核桃CDPK基因家族鉴定与转录表达分析

庄丽丽,宋林眉,王芳,李玉群,张柱岐,刘凯*

(1.滨州职业学院,山东滨州 256603;2.滨州高新区青田街道办事处,山东滨州 256603)

核桃(JuglansregiaL.)是中国广泛栽培的经济林树种,具有较高的生态、社会和经济效益,深受消费者喜爱,被列为“四大坚果”之一。目前,外界恶劣环境严重影响核桃树体的正常生理活动[1]。钙依赖型蛋白激酶(calcium dependent protein kinase,CDPK)是植物体内一类重要的Ca2+结合蛋白,通过Ca2+信号转导参与植物响应非生物胁迫的过程[2]。CDPKs家族各成员间的蛋白结构比较保守,均含有4个高度保守的结构域:N端可变域(N-terminal variable domain)、丝氨酸/苏氨酸激酶域(protein kinase domain)、自抑制域(auto-inhibitory domain)和类钙调素结合域(calmodulin-like domain)[2]。CDPKs家族蛋白是由一个编码CaMK的基因与一个编码钙调素的基因在进化中融合而形成的[3]。目前CDPK家族基因已在拟南芥[4]、水稻[5]、辣椒[6]、黄瓜[7]、西瓜[8]、梨树[9]、杨树[10]等许多植物中被鉴定出来。有研究指出CDPKs依赖脱落酸途径缓解干旱胁迫带来的影响[11],而且参与植物对低温胁迫的响应过程[12]。研究表明CDPKs通过磷酸化激活下游目标基因来参与响应逆境过程[13]。本研究通过生物信息学分析鉴定核桃基因组中的CDPK家族成员,分析该家族成员结构,并研究其在冷胁迫和不同组织中的转录水平,为进一步明确核桃CDPKs家族基因响应冷胁迫应答机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

转录组测序材料为2年生盆栽的嫁接苗,品种为清香,砧木为赞美;将盆栽苗通过人工气候室模拟0.5 ℃冷胁迫,分别放置时间为0,4,8,12,24,36,48 h,采样及测序参照刘凯[14,15]方法。测序数据已上传到国家基因组科学数据中心,网址为(https://bigd.big.ac.cn/?lang=zh),项目编号为 PRJCA006073。

不同组织(根、嫩茎、嫩叶、雄花、雌花、老叶)参照刘凯[14]方法采样后进行RNA测序。

1.2 试验方法

1.2.1核桃CDPK基因家族分析 根据Uniport(https://www.uniprot.org/)拟南芥CDPK家族蛋白序列构建隐马尔科夫模型,并于NCBI搜索下载核桃蛋白序列(GCF_001411555.2),结合转录组分析对家族成员进行鉴定。

利用NCBI在线分析软件ORF Finder (https://www.ncbi. nlm.nih.gov /orffnder/)查找CDPK基因家族成员的ORF。蛋白质的理化性质使用ExPASy (https://web.expasy.org/ protparam/)在线网站分析;利用ngLOC与Nuc-PLoc在线软件(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Nuc-PLoc/)进行亚细胞定位预测。

1.2.2核桃CDPK家族基因转录表达分析 冷胁迫48 h后分析清香的转录表达,以FPKM(每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments)为测定标准进行基因转录水平分析。

2 结果与分析

2.1 核桃基因组CDPK家族成员鉴定及分析

核桃基因组CDPK家族成员基本信息。利用拟南芥CDPK家族蛋白序列构建隐马尔科夫模型,以此来搜索核桃CDPK蛋白数据,初步筛选出52个核桃CDPK家族基因。利用Pfam结构域分析,去除冗余后最终获得38个核桃CDPK家族基因,编码38条蛋白质序列,根据染色体位置并对其命名。这些CDPKs基因开放阅读框长度在399～2 181 bp,翻译后蛋白长度在132～645个氨基酸;等电点在5.34～9.14之间;利用ExPasy进行稳定性预测,结果显示该家族有10个成员为不稳定蛋白;利用ngLOC和Nuc-PLoc在线软件预测结果显示,38个核桃CDPKs 蛋白均定位于细胞核。

2.2 不同物种 CDPK 家族进化树分析

本研究对核桃(38个)、拟南芥(18个)CDPK家族蛋白进行了系统发育分析(图1)。结果表明,核桃与拟南芥 CDPK家族基因有一定的同源性,将有助于进一步研究该基因家族成员功能的研究。

图1 CDPK家族基因的系统发育树分析

2.3 核桃CDPK家族成员转录表达分析

将清香盆栽苗在人工气候室0.5 ℃条件下,进行不同时长冷处理,进行RNA-seq分析后结果表明,核桃JrCDPK家族38个基因出现不同的响应(图2),其中0～36 h时,JrCDPK4转录表达水平呈明显上升趋势,48 h时开始下降。通过对不同组织进行转录表达分析,结果表明JrCDPK4、JrCDPK25、JrCDPK26在根中转录表达水平较高;JrCDPK28在雌花中转录表达水平较高;JrCDPK25在芽中转录表达水平较高。

图2 JrCDPK家族基因的转录表达分析注:左为冷害胁迫处理不同时间,T0为对照,T4、T8、T12、T24、T36、T48分别代表了冷胁迫处理4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h。右为不同组织表达,CH:雌花;G:根;LY:老叶;NJ:嫩茎;NY:嫩叶;XH:雄花;Y:芽。

3 讨论与结论

CDPK家族基因在植物的生长发育、代谢调节、逆境胁迫过程中均有着重要作用[16]。随着全基因组的测序,目前在多种植物中已经鉴定出CDPK转录因子家族,其中辣椒30个[6]、西瓜22个[8]、梨树31个[9]、杨树30个[10]等。本研究通过生物信息学在核桃全基因组中挖掘鉴定出38个CDPK家族基因,并对其成员进行结构与表达分析,丰富了植物CDPK基因家族种类。本研究对核桃的38个与拟南芥的18个CDPK家族蛋白构建系统发育树,发现核桃与拟南芥 CDPK家族基因有一定的同源性,与林欢[6]等研究结果一致。

目前,已有研究证实CDPK基因能够响应冷害胁迫。高圆丽[17]等采用农杆菌介导法,利用pPZP221-CDPK20对烟草叶片进行遗传转化,验证了山药CDPK20基因在山药植株中耐低温性的作用;ZHAO[18]等根据桃子采后不同处理的RNA-seq数据,证明PpCDPK2、PpCDPK7、PpCDPK10、PpCDPK13与采后冷胁迫相关;刘伟[19]验证了CDPK基因在棉花低温胁迫响应中起着重要作用。本研究通过清香, 0.5 ℃冷处理48 h后进行转录组测序,发现冷胁迫48 h后核桃JrCDPK4转录水平显著升高,并在根和嫩叶中转录水平较高,推测该基因可能参与响应冷胁迫以及核桃根、嫩叶的生长发育,将为揭示核桃CDPK基因响应冷胁迫机理奠定基础。