树木叶片衰老中的氮素再吸收机制研究进展

杨甲定,刘雨节,冯建元,2,张远兰

(1.南京林业大学,南方现代林业协同创新中心,南京林业大学生命科学学院,江苏 南京 210037;2. 江苏食品药品职业技术学院,江苏 淮安 223005)

氮是植物生长发育中需求量最大的营养元素[1],在自然生态系统中,氮素缺乏是限制植物生长与分布的常见环境因子之一,而在人工农林生产系统中,施用氮肥以保证土壤中存在足够的氮素营养是保障植物生物量生产的重要措施之一[2]。据估计,全球每年有超过1亿t合成氮肥的施用来支持农业生产,但由于农作物的氮素利用效率普遍低于50%,有近一半的外施氮素并没有被植物所吸收而流失到环境中。我国人口众多,每年需施用大量氮肥来确保农作物丰收,但大量化肥投入并没有带来成比例粮食产量的提高,化肥利用率仅为30%左右,因此农业生产存在“高肥低效”的问题[1]。就林业而言,天然林通常不需要化肥的投入,但人工林(plantation forests)作为当前木材相关产品的重要来源,因其速生和短轮伐特性,每年需要密集的管理和投入,其中重要的内容就是化肥的施用。大量氮素的投入不但意味着农业生产成本的增加,而且氮素向环境的流失,带来土壤酸化、土壤和水体富营养化、温室气体大量排放等一系列的环境问题[3]。因此,如何在保证农林系统生物量生产的前提下,减少氮肥施用,减轻环境污染,成为亟待解决的现实和科学问题[4]。

近年来,以提高植物氮素利用效率(nitrogen use efficiency, NUE)为目标的研究正成为植物学、农学领域的研究热点之一[5],但与树木相关的机理解析和应用研究尚不多见。培育具有较高NUE的作物和林木新品种,不仅可以一定程度上减少植物根际土壤氮素的流失,有利于改善环境,同时有助于减少农林生产中人工氮肥的施用,降低生产成本,维持可持续生产经营。笔者对植物(侧重于树木)叶片衰老与氮素再吸收的关系及其分子调控机理等方面进行综述,并就未来研究的方向进行探讨,以期为培育具有高氮素再吸收效率的落叶树木新种质提供科学参考。

1 植物氮素利用效率的基础

在农业系统中,由于人工化肥的大量施加,土壤中的无机氮(硝酸盐和铵盐,包括有机氮肥尿素在脲酶的作用下生成的铵态氮)含量较高,是作物根系主要吸收的氮源。土壤酸碱性会影响无机氮的存在形式,即在通气良好的土壤中以硝态氮为主,在水淹或酸性土壤中以铵态氮为主[6]。而在人工干扰较少的特定生态系统中(比如北方或北极的森林或草地),土壤有机氮(比如氨基酸、氨基糖和核苷酸等)通常有较高的水平而作为植物吸收的主要氮源[7]。植物除了可以从土壤中直接获得氮素之外,豆科(Leguminosae)植物能够通过与土壤中细菌共生形成根瘤,通过固定大气中的氮气为植物提供铵态氮[8]。

植物对氮素的利用包括几个步骤,即吸收、同化/转运、再吸收/转运等,这些步骤的活性在物种(或亚种)间、植物不同发育阶段、不同植物组织/器官间存在差异,而且受到各种外界环境条件的影响,因此植物氮素利用效率是一个涉及遗传因素和环境因素互作的复杂性状,是植物根系对土壤氮素的吸收、植株对所吸收氮素的同化与利用、衰老组织/器官中氮素的再吸收等多方面效率的综合表现[4]。解析植物氮素利用效率形成的限速步骤或环节,有助于有针对性地调控这些步骤或环节以提高氮素利用效率。

1.1 氮素吸收(nitrogen uptake)

植物根系吸收土壤中不同形态的氮素由相应的转运蛋白完成,根据其对所转运氮素的亲和性分为低亲和和高亲和转运系统[5]。①植物对硝态氮的吸收由硝酸盐转运蛋白(nitrate transporter,NRT)完成[9]。硝酸盐转运蛋白在植物体内成员众多,以拟南芥(Arabidopsisthaliana)为例,已知有72个硝酸盐转运相关的蛋白,分为NRT1、NRT2、CLC和SLAC/SLAH等4类[10],其中NRT1成员最多,达53个,主要是低亲和性转运蛋白,负责在高浓度硝酸盐条件下对硝酸离子的吸收,但某些成员专一性不强,除了硝酸离子,还可转运二肽、多种激素或硫代葡萄糖苷。拟南芥AtNRT1.1是植物中第一个被鉴定的硝酸盐转运蛋白,不仅可参与根系对硝酸盐的吸收,也参与硝酸盐由根向茎的转运,而且其对硝酸离子的亲和活性具有高低两种状态,通过其蛋白上Thr101的磷酸化(表现高亲和性)与去磷酸化(表现低亲和性)转换亲和性[11]。与NRT1不同,NRT2家族成员均对硝酸盐转运表现高亲和性,参与在低硝酸盐浓度下根系对硝酸离子的吸收(或转运)过程,拟南芥中有7个成员(AtNRT2.1-2.7),除AtNRT2.7外,其他成员均需辅助蛋白(AtNAR2.1)的协助才能发挥其转运功能。②植物对铵盐的吸收由铵盐转运蛋白(ammonium transporter,AMT)完成,在拟南芥中,转运铵盐的AMT蛋白家族有6个成员,即5个AMT1成员(AMT1;1-1;5)和1个AMT2[12]。根系对铵盐的吸收由AMT1;1、AMT1;2、AMT1;3、AMT1;5等4个AMT蛋白负责,均为高亲和性铵转运蛋白,其中AMT1;1、AMT1;3和AMT1;5在根表皮细胞表达而AMT1;2则在根系皮层和内皮层细胞中表达。拟南芥四突qko(即amt1;1amt1;2amt1;3amt2;1)在以铵盐为唯一氮源的生长条件下表现出严重的生长受阻,而且根系对铵盐的高亲和吸收活性仅为野生型中活性的5%～10%[13]。③植物对有机氮源吸收的研究聚焦于氨基酸方面,根系吸收氨基酸被认为是通过氨基酸转运蛋白APC(amino acid-polyamine-choline,氨基酸-多胺-胆碱)超家族中的3个亚家族成员:AAPs(amino acid permeases)、LHTs(lysine/histidine-like transporters)和ProTs(proline and glycine betaine transporters)完成[14]。不同家族之间以及家族之内,各转运蛋白对底物的特异性和亲和性存在差异,比如拟南芥AAP1参与根系对谷氨酸和中性氨基酸的吸收,而AAP5在碱性氨基酸的摄取中发挥功能;LHT1转运中性和酸性氨基酸进入根,而LHT6负责从根际空间吸收酸性氨基酸、谷氨酰胺和丙氨酸;ProTs则转运可作为渗透调节剂的脯氨酸和甘氨酸甜菜碱[15]。相对而言,植物根系对氨基酸的吸收尚有待深入研究。无论是无机氮源还是有机氮源的转运蛋白,其基因的表达不仅受植物体内营养水平的调控,也受到土壤氮素水平、温度、光照、土壤其他理化性质的影响,反映了植物根系吸收土壤氮素的灵活性[16]。

1.2 氮素同化(nitrogen assimilation)

植物根系吸收的硝酸离子,一部分会储存在根系细胞的液泡中,另一部分则在根中经胞质硝酸还原酶和质体亚硝酸还原酶催化还原为铵盐,并与根系吸收的铵盐一起在根细胞内同化合成氨基酸和蛋白质;其他大部分硝酸离子会随木质部液流运输,在地上部茎叶中还原为铵,再进一步同化。铵盐的同化主要通过谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)、谷氨酰胺-氧戊二酸转氨酶(glutamine oxoglutarate aminotransferase,GOGAT)和天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase,AS)催化而生成氨基酸[17]。谷氨酰胺合成酶是氮同化过程的关键酶,根据亚细胞定位,可分为胞质型GS1和质体型GS2,其中GS1在根中发挥氮同化的主要作用,特别是在高硝酸盐浓度时;而GS2主要负责在叶肉细胞内的氮同化和再同化光呼吸产生的铵[15]。无机氮同化过程产生的氨基酸和根系吸收的氨基酸均可被用于细胞内蛋白质的合成,同时地上部合成的氨基酸也可通过韧皮部运回至根系,因此植物体内存在着根系与地上部之间的氮素交流系统,这种氮素交流的强度受到植物种类、植物发育状态和环境因子的影响[18]。

1.3 氮素再吸收(nitrogen resorption)

氮素同化后产生的绝大部分氨基酸会用于蛋白质的合成,既发挥酶的催化功能也作为氮的储藏。叶片中存在大量非活性的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)和谷氨酰胺合成酶GS2很可能就是一种氮素的贮藏形式[15]。氮素再吸收就是分解源器官(如衰老叶片)中的储藏蛋白,以氨基酸或酰脲的形式将氮素转运至幼嫩器官或储藏器官。1年生模式植物和作物中的大量研究表明,氮素再吸收的最主要转运形式是氨基酸和小肽。衰老叶片氮素再吸收有3个连续的环节,即蛋白质降解(degradation of leaf proteins)、氨基酸相互转变(interconversion of amino acids)和氨基酸向韧皮部的装载(phloem loading of amino acids)[19]。①蛋白质的降解主要通过自噬途径和蛋白水解酶完成,在拟南芥叶片衰老阶段,大量蛋白水解酶基因和自噬基因的表达上调,暗示了二者在氮素再吸收中的作用。②蛋白质降解生成的氨基酸并不是随机运输的,研究表明衰老阶段韧皮部液流中含量最多的氮素转运形式是谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸等特定氨基酸,因此存在其他氨基酸向这些特殊氨基酸的转变反应。这种反应被认为发生在叶肉细胞和筛管伴胞的线粒体和细胞质内,主要催化酶为谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH)、谷氨酰胺合成酶1(glutamine synthetase 1,GS1)和天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase,AS)等[17]。③筛管是运输氨基酸回流的通道,虽然推测氨基酸从叶肉细胞进入筛管既可通过胞间连丝介导的共质体途径也可通过质外体途径,但拟南芥和大多数作物中的研究表明氨基酸进入筛管是质外体装载过程,即氨基酸首先从薄壁细胞或维管束鞘细胞以被动运输方式进入叶片质外体,随后由定位于韧皮部伴胞细胞膜的转运蛋白将质外体的氨基酸运入韧皮部,这一环节通常认为是氮素由源(比如衰老叶片)向库(储藏器官)转运的限速环节[20-21]。

2 植物叶片衰老与氮素再吸收

氮素再吸收通常发生在整体植株或特定组织/器官进入由发育年龄引发的自然衰老或因环境胁迫诱导的提前衰老时[17,22]。衰老(senescence)作为一种以发育年龄为内因的程序性过程,可以发生在细胞、组织、器官和整体植株等不同水平[23]。叶片衰老是叶片正常生长发育的最后一个生物学阶段[24]。营养生长期的叶片作为光合器官,也是活跃同化氮素的主要场所;随着进入衰老阶段,叶片的光合能力和氮素同化代谢逐渐衰弱,而叶绿素、蛋白质、糖、脂质等大分子的分解逐渐增强,因此形态上的失绿是叶片衰老最明显的特征,而代谢上则主要是叶绿素的降解和叶绿体结构的解离,使叶片转变为净向外输出营养成分的源器官,最终导致叶片的死亡[23]。叶片衰老虽然发生在器官水平,但与整体植株的生长发育密切相关:当1年生植物进入生殖生长阶段,比如大田作物小麦(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)等开花进而孕育籽粒时,会启动叶片的衰老进程,同时整体植株趋向自然死亡;而对多年生落叶树木而言,叶片自然衰老通常伴随着每年秋季叶片颜色由绿变黄或变红以及叶片凋落,表明树木结束当年的生长期而进入休眠期[25]。虽然在适宜的生长条件下,叶片的衰老主要依赖于发育年龄,但各种内源因素(激素含量、营养物积累等)和外源环境因子(光周期、温度、水肥供应、病虫害等)可以影响衰老的启动与进程[24],特别是在非生物环境胁迫条件下,植物往往通过提前启动成熟叶片的衰老来再吸收其中储藏的营养资源(比如氮素)以保证其幼叶发育或完成种子生产,因此环境胁迫引发的叶片衰老进程也与植物对环境的适应能力相关联[22]。

1年生植物/作物叶片衰老所输出的氮磷等营养成分主要用于新器官(如新叶和种子)的生长发育,特别是以籽粒为收获对象的1年生农作物,在其生殖生长阶段的花序生长、种子发育以及籽粒产量主要依赖从衰老叶片中再吸收的营养[19],比如水稻、小麦、大麦(Hordeumvulgare)等作物营养器官中,最高可达90%的氮素会被再吸收转运至籽粒[2]。大量大田研究也表明,作物衰老叶片的氮素再吸收效率决定了籽粒的产量[26],而且在作物发育的适当阶段促进叶片的衰老可以促使更多的营养成分向籽粒输送,从而提高籽粒的营养价值,比如具有更高的蛋白含量和某些微量元素的含量等[27]。另一方面,延缓叶片衰老意味着叶片光合功能保持更长时间,有利于光合同化物的生产,可以提高植株生物量的积累,特别是对绿叶蔬菜作物来说,延缓叶片衰老还有利于保持蔬菜的采后品质以及延长储运时间,降低采后损失[28]。因此,阐明植物(作物)叶片衰老和营养再吸收以及利用的调控机理,可在农业生产中根据所收获植物器官的差别(比如是叶片还是籽粒),有针对性地调控叶片的衰老进程(即在特定阶段延缓或促进农作物的叶片衰老),从而更精准地为农业生产服务。

与1年生农作物不同,多年生木本落叶植物(落叶树木)每年秋季的叶片衰老过程中,伴随着叶绿素的降解,叶片内的部分氮素营养会再吸收回枝条、茎干甚至根系[24]。生长于福建滨海同一地区的4种红树植物表现出不同的衰老叶片氮素再吸收效率:拒盐红树秋茄(Kandeliaobovata)和木榄(Bruguieragymnorrhiza)的氮素再吸收效率较高,分别为73%和83%,而泌盐红树白骨壤(Avicenniamarina)和桐花树(Aegicerascorniculatum)则较低,分别为66%和42%[29];生长于墨西哥中部山区的两种落叶栎树(Quercuscastanea和Q.deserticola)表现出不同的叶片氮素再吸收效率,分别为87.9%和82.4%[30];生长于干热河谷区的林龄为9、15和26 a的新银合欢(Leucaenaleucocephala),或生长于滨海沙地的林龄为4 、8、13 a的尾巨桉(Eucalyptusgrandis×E.urophylla),其叶片对氮素养分的再吸收率均表现出随林龄的增大而下降的趋势[31-32];以重庆石灰岩地区15种常绿木本植物和14种落叶木本植物为对象的研究结果则表明常绿植物基于单位质量叶片养分含量计算的氮素平均再吸收效率为39.42%,高于落叶植物的24.08%[33];我国太行山地区阔叶人工林树种刺槐(Robiniapseudoacacia)的叶片氮素再吸收效率为34%～53%,而针叶树侧柏(Platycladusorientalis)的养分再吸收不明显[34];在养分亏缺条件下生长的日本落叶松(Larixkaempferi) 其叶片氮素再吸收效率可达 76.3% ,但在营养充分条件下为56.8%[35]。这些研究说明树木叶片的氮素再吸收效率不仅与树种、树木年龄、树种功能类型(落叶或常绿、针叶或阔叶)等有关,也受生长环境、土壤氮素水平、水分供应等环境因子的影响[36]。同时在全球尺度上,衰老叶片的氮素再吸收效率与植物生长区域的纬度显著正相关(即随着纬度的升高而升高),但与年平均气温、年平均降水量显著负相关(即随年平均气温和降水量的升高而降低)[37]。

叶内氮素再吸收回到枝条等器官不仅有助于增强植物对外界寒冷/干旱胁迫的抵抗能力,而且这些营养物质在第2年春季可以再动员转运,用于芽、叶、花的萌生,从而有利于提高植物的生存竞争能力[38]。利用15N标记手段检测春季根系对氮素的吸收,发现许多落叶树种包括杨树(Populustrichocarpa)[39]、欧洲花楸(Sorbusaucuparia)[40]、苹果(Malusdomestica)[41]等,其春季枝条内储藏氮素的再利用要比根系对氮素的活跃吸收早20～30 d发生,说明其春季地上部的初生长(新叶和花的萌生)依赖于对枝条内所储藏氮素营养的再利用,而不依赖于春季的根际肥料施用。新近有关橡胶树(Heveabrasiliensis)的研究表明,落叶期再吸收的氮素主要贮藏在主干和根系,其15N分配率为 59.58%左右,以主干木质部的15N分配率最高;这些贮藏氮在翌年春季会有超过一半再分配用于新生器官的生长发育,并且上一季的适量施肥对贮藏氮的分配率有一定的提高作用[42]。这些结果说明落叶树种在春季的最初长势可能主要取决于枝条或根系中的贮藏氮素营养,而这一营养积累又与上一年秋季落叶前叶内氮素营养的再吸收过程紧密正相关。因此,通过提高树木衰老叶片的氮素再吸收效率促使更多氮素营养从衰老叶片转运回枝条或其他贮藏组织,不仅减少了树木因落叶导致的体内氮素损失,而且在某种程度上降低了树木下一季生长对外源氮肥的需求,这对大面积落叶人工林来说具有节省化肥施用、降低经营成本的潜在应用价值。

3 衰老叶片氮素再吸收的调控机理

叶片衰老是一个受到严格调控的程序化过程,在机理上体现为叶片细胞在基因表达、信号传导、代谢及结构等层次的有序变化[43]。近年来有关植物叶片衰老的研究已深入到分子水平。在1年生模式植物和农作物中,通过从T-DNA插入突变体库或化学诱变突变体库中筛选叶片衰老表型发生改变的突变体,成功鉴定了许多重要的参与叶片衰老的正负调控因子;利用差异表达技术或全基因组转录组分析,已经从多种植物中筛选出大量的衰老相关基因(senescence associated genes,SAGs),其表达水平在叶片衰老的特定阶段上调,暗示SAGs在叶片衰老进程中发挥一定功能。根据我国科学家创建的叶片衰老数据库(Leaf Senescence Database, https://ngdc.cncb.ac.cn/lsd/index.php)[44],在87个物种中鉴定到SAGs,其中SAG数目较多(>100)的物种有拟南芥、香蕉(Musaacuminata)、毛果杨(P.trichocarpa)、中国白菜(Brassicarapa)、棉花(Gossypiumhirsutum)、玉米、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、毛白杨(P.tomentosa)、欧美杂交杨(P.tremula×P.tremuloides)、水稻、高粱(Sorghumbicolor)、大豆和小麦。但这些植物中大多数SAG的确切功能尚未得到实验确证。拟南芥中有3 920个SAGs,其中大约11%的基因的表达蛋白是转录调控因子(TF),以NAC、WRKY、C2H2锌指蛋白、AP2/EREBP和MYB等家族的数量较多,暗示这些家族的TF可能调控不同的下游靶基因和代谢环节,由此组成一个极其复杂的转录调控网络来精细协调拟南芥叶片的衰老过程[45]。同时,其他层次(比如表观遗传水平、转录后水平、可变剪接、蛋白水平和代谢水平)的调控机理尚有待深入阐明[46]。另外,植物激素在叶片衰老中有重要调节作用[47],通常根据叶片衰老进程中各类激素的含量变化和外源施用对植物衰老的影响,将植物激素分为延缓衰老激素(包括生长素、赤霉素和细胞分裂素等)和促进衰老激素(包括脱落酸、乙烯、茉莉酸、水杨酸、独脚金内酯等)两类,由于植物激素信号转导途径存在交叉联系,一种激素对叶片衰老的调节作用可能取决于物种、植株的发育阶段或生长环境条件和激素浓度等因素[23]。

与1年生模式植物和作物相比,对木本植物的叶片衰老研究并不多。Bhalerao等[48]以欧洲山杨(P.tremula)自然条件生长但无可见衰老表型的秋叶和温室生长完全展开的P.tremula×tremuloides幼叶为材料,构建两个cDNA文库,分别获得5 128和4 841个表达序列标签,发现两个文库具有完全不同的基因表达模式:在秋叶中,编码金属硫蛋白、早期光诱导蛋白和半胱氨酸蛋白酶的表达序列标签最为富集,而编码其他蛋白酶和参与呼吸、脂类和色素降解的蛋白以及胁迫相关的基因也显著存在;另外,间接估计秋叶中质体蛋白的合成速率低于幼叶中速率的10%。Andersson等[49]利用包含13 490个基因克隆的生物微芯片,对瑞典北部自然生长的欧洲山杨叶片从8月17日到9月21日自然衰老7个时间点的转录活性进行检测,发现3 792个代表性基因具有显著表达变化,其中包括与叶绿素降解、线粒体呼吸、脂肪酸氧化分解以及营养转运相关的基因(比如蛋白酶基因),表现出与拟南芥叶片衰老相关基因SAG相似的表达模式。Wen等[50]以亚热带地区生长的落叶树木枫香(Liquidambarformosana)为研究对象,利用RNA测序技术检测了4月绿叶和12月红叶的转录组活性,并利用生物微芯片技术对连续3年(2011—2013)生长季基因表达水平进行检测,发现WRKY基因家族成员(LfWRKY70、LfWRKY75和LfWRKY65)和NAC基因家族成员(LfNAC1和LfNAC100)以及其他一些转录因子(LfSPL14和LfMYB113)是叶片衰老的关键调控基因;通过对叶片衰老时的上调基因进行调控网络分析,发现被LfWRKY75、LfNAC1和LfMYB113所调控的某些基因正是与叶片衰老中叶绿素降解和花青素合成相关的候选基因。与这一结果类似,在1年生模式植物拟南芥中,AtWRKY75被鉴定为叶片衰老中依赖于年龄的正调控因子,其表达水平在叶片衰老中上调,并且与水杨酸合成和活性氧H2O2清除相偶联[51]。Li等[52]对大田生长的3株毛白杨在16个时间点(2018年9月22日—11月17日)的叶片进行RNA测序,发现14 776个差异表达基因,其中有3 459个基因属于叶片衰老正相关基因,在叶片衰老进程中表达上调,其功能主要是参与糖、脂、氨基酸等的代谢途径和调控激素响应。这些杨树叶片衰老正相关基因与拟南芥衰老相关基因(3 852个)之间有1 029个同源基因是重叠的,暗示多年生植物叶片的秋季衰老和1年生植物叶片衰老具有高度的相似性。基因共表达网络分析发现,来自31个家族的115个衰老相关转录因子为衰老节点转录因子,特别是衰老相关的NAC转录因子在控制杨树叶片衰老中发挥着关键作用,其中PtNAC013/PtRD26转录因子被鉴定为节点正因子,可直接调控下游的多个衰老相关基因,包括其他NAC基因(即PtORE1和PtNAP)和参与叶绿素降解(PtSGR1)、叶绿体蛋白降解(PtCV)和赖氨素代谢(PtLKR)的基因以及参与茉莉酸合成(LOX2)、乙烯合成和信号转导(ACS6和PtEIN3)的基因等。更有意思的是,PtRD26在衰老叶片中会转录产生1个携带一段内含子的可变剪接体PtRD26IR,其编码蛋白作为负调控因子,可延迟杨树叶片的各类衰老过程(如年龄依赖的、黑暗诱导的以及PtRD26诱导的衰老)[53]。总之,目前对木本植物叶片衰老的研究多以组学手段挖掘衰老相关的差异表达基因,对可能的关键基因的功能验证以及精细的调控途径解析尚不多见,特别是与叶片衰老氮素再吸收相关的研究有待加强。

分析植物衰老相关的研究可知,迄今经实验确证的与叶片衰老营养转运相关的转录因子主要是NAC家族蛋白。在拟南芥和水稻中,其突变能导致植物叶片自然衰老延迟的基因推测可能对衰老叶片中营养(氮素)的再吸收有正调控作用,如拟南芥AtNAP基因的功能缺失导致植株衰老延迟(即相对于同龄的野生型植株,突变体nap叶片有更高的叶绿素和氮素含量)[54]。在小麦中下调TtNAM-B1同源基因的转录水平可以延缓植株的自然衰老,导致旗叶中的蛋白含量提高而籽粒中蛋白含量降低,说明从叶片到籽粒的氮素转运受到一定抑制[55]。在水稻中超表达OsNAP使植株自然衰老提前,促使更多营养向籽粒转运,使籽粒的蛋白含量和其他7种元素的含量均显著提高[27]。这些研究表明,某些NAC转录因子具有调控叶片衰老中氮素转运的功能。Tang等[56]结合3年大田试验的基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)和功能验证,在水稻中发现了1个双亲合硝酸根转运蛋白OsNPF6.1HapB的优异单体型植株,在低氮生长条件下表现出更强的氮素吸收能力和籽粒产量的提高;而且鉴定到1个NAC转录因子OsNAC42,能通过结合OsNPF6.1启动子上的CACG元件而激活OsNPF6.1的表达,由此揭示了利用OsNAC42-OsNPF6.1信号节点来提高水稻氮素利用效率的分子育种途径。最近,在柳枝稷(Panicumvirgatum)中发现1个核定位的CCCH型锌指蛋白PvSSG,尽管不具有转录调控活性,但表现为叶片衰老的抑制因子,超表达或抑制其基因的表达,可延迟或加速叶片衰老;酵母双杂交筛选到PvNAP1/2是PvSSG的互作蛋白,由于PvNAP1/2是叶片衰老的正调控因子,可直接转录激活下游的叶绿素代谢基因,表明PvSSG是通过与PvNAP1/2蛋白互作,减弱PvNAP1/2对其下游靶基因的转录激活作用,从而对叶片衰老进程起到“刹车”作用[57]。尽管这些研究并没有考察所鉴定的对叶片衰老有正调控作用的基因是否也调控叶内的氮素转运,但基于氮素再吸收与叶片衰老的密切偶联关系,推测这些衰老正调控因子应会对氮素再吸收产生影响,但究竟是直接调控氮素再吸收的某一生理环节还是通过其他调控因子间接影响氮素转运,尚有待解析。

4 展 望

由于现有的关于树木氮素再吸收的研究多从生理生化水平研究氮素营养的季节性动态和对树龄、外界水肥供应、胁迫因子的响应,从分子水平解析树木叶片衰老氮素再吸收的调控机理尚不多见,未来应加强以下方面的研究:

1)功能鉴定调控树木叶片衰老氮素再吸收的关键转录因子。可以借鉴1年生植物中的研究成果,先从解析某些已知在树木叶片衰老进程中表达上调的特定NAC、WRKY家族成员入手[53],通过转基因超表达和基因编辑敲除,分析其对叶片衰老进程和衰老氮素转运的影响,相应地考察氮素再吸收效率的变化,由此鉴定出具有提高植物氮素利用效率潜力的特定成员。

2)由于衰老叶片中氨基酸由质外体向韧皮部的装载是氮素再吸收的限速环节,需要从众多的氨基酸转运蛋白中鉴定出定位于筛管伴胞细胞膜且在氨基酸运入韧皮部中发挥关键功能的特定成员。可以首先筛选在叶片衰老中表达上调的氨基酸转运蛋白基因,通过考察这些基因的启动子在叶片不同组织的活性和所编码蛋白的亚细胞定位,获得定位于筛管伴胞细胞膜的特定成员,进而分析上调/下调该转运蛋白对衰老叶片氨基酸再吸收的影响。

3)植物激素脱落酸和乙烯对叶片衰老进程发挥促进作用,不仅二者的内源含量在叶片衰老中上升而且外施一定浓度的激素溶液均可诱导叶片的提前衰老变黄[58]。由于这两类激素在模式植物中的信号转导元件已相当清楚,可以通过在树木中遴选各元件的同源基因,鉴定其是否在叶片衰老与氮素再吸收中发挥功能,并就其与上述特定NAC或WRKY转录因子和特定的韧皮部氨基酸转运蛋白之间的可能互作关系进行分析。

另外,参照1年生作物和模式植物中的研究,也应关注树木叶片衰老和氮素再吸收中表观遗传水平的调控、非编码RNA(包括小分子核糖核酸miRNA和长链非编码核糖核酸lncRNA等)和小肽等的作用。通过功能鉴定并筛选树木叶片衰老氮素再吸收过程的关键调控因子或节点,将可能为分子育种提供可靠的靶标,有助于未来通过遗传改良培育具有较高氮素利用效率的树木新品种。