白藜芦醇和环糊精包合物合成及再矿化作用评价

黄路梅,陈 晨

牙本质是由胶原基质和分级排列的磷灰石纳米晶体组成的胶原矿化组织。矿化物质支撑牙本质胶原,共同实现牙本质的机械性能和维持生物学特性。当前牙本质粘接技术条件仍无法做到使树脂单体在混合层底部实现胶原纤维的完全包裹,这就造成了混合层中胶原纤维被降解、进而出现纳米渗漏[1-2],也是当前牙本质粘接耐久性问题的根源所在。这种情况下,通过牙本质仿生再矿化以改善胶原基质生物力学性能和有效抑制胶原纤维的生物降解则被认为是提高树脂-牙本质粘结耐久性的替代解决办法[3-5]。天然多酚陆续被尝试用于牙本质再矿化[6-10],其中白藜芦醇被证实具有较好的再矿化促进作用[6],这种活性作用具有浓度依赖性[11],然而另有研究发现,白藜芦醇在局部高浓度(10～40 μg/mL)时会表现出细胞毒性。因此,寻找方法使白藜芦醇适当富集而又避免局部高浓度产生的细胞毒性无疑对增强其再矿化促进效果及潜在的临床应用是有益的。当前研究的目的即通过环糊精包嵌白藜芦醇以使在不具细胞毒性的基础上提升其再矿化活性并实现一定的缓释。

1 材料与方法

1.1 白藜芦醇-环糊精包合物的合成及表征

称取白藜芦醇(MO,美国),加入乙醇(沃凯,中国上海),使其充分溶解;称取环糊精,加入水搅拌使其溶解成为饱和溶液,置于恒温磁力搅拌器(国华,中国上海)上搅拌;再将白藜芦醇的乙醇溶液逐滴加入到环糊精溶液中,继续搅拌24 h,冷却,静置60 min,抽滤,-80 ℃过夜,结冰后真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器,中国北京)制成蓬松的块状物质,研碎,获得白藜芦醇-环糊精包合物。

分别取微量包合物粉末,以纯白藜芦醇粉末对照,采用KBr压片法,测试红外光谱(Nicolet 6700,Thermo Scientific公司,美国),衰减全反射设置为4 cm-1分辨率和32次扫描。测试范围:4 000～400 cm-1。

称取少量的白藜芦醇和包合物,放入综合热重分析仪内(TGA-4000,PerkinElmer公司,美国)对其进行热重测定,测定条件:温度范围为0～800 ℃,升温速度为10 ℃/min,N2流速为40 mL/min。

1.2 细胞毒性评价

以单纯乙醇溶剂作为对照组,测试1、5、10 μg/mL 4种浓度的白藜芦醇组/包合物的细胞毒性。测试方法如下:人牙髓干细胞(北纳生物,BNCC354453,中国苏州)在37 ℃下,在DMEM培养基(Gibco,中国北京)中加入10%胎牛血清(麦克林,A801320,中国上海)和双抗后培养。96孔板每孔加入约5 000个细胞,每组设置3个复孔,然后将细胞置于37 ℃ 5% CO2细胞培养箱中培养24 h。24 h后按组别加药,加药后分别孵育1、3、5、7 d。加入配制好的CCK8液(新赛美,C6005,中国苏州)观察OD值。

1.3 体外释放度的测定

将相当于3 mg的白藜芦醇、包合物分别置于(37±0.5)℃、体积为900 mL的水中,分别在预定的时间点取样1 mL(同时补充1 mL水),使用紫外-可见8 452A二极管阵列分光光度计(美国加州帕洛阿尔托惠普公司)在307 nm波长处测定白藜芦醇吸光度,计算累积释放度(Q)。释放度=溶液中释放的白藜芦醇容量/投入白藜芦醇总质量×100%。

1.4 白藜芦醇-环糊精包合物对牙本质表面再矿化的作用

经南京医科大学伦理委员会批准(伦理号(2019)277),于2023年4月—5月在口腔颌面外科门诊收集新鲜拔除、无龋坏的第三磨牙,去除牙周软组织,使用低速切割机切割出0.5 mm×2.0 mm×2.0 mm牙颈部的牙本质片,使用前浸泡在4 ℃ 0.1%的麝香草酚溶液中。

制备10 mg/mL白藜芦醇-乙醇溶液,10 mg/mL包合物/乙醇溶液,并在使用前在4 ℃下储存。将牙本质切片浸入37%磷酸中以进行完全脱矿(使用口腔内牙科X射线设备(Focus 50540-IMG,KAVO,美国)进行检查),用双蒸馏水完全冲洗,并吸干。然后,将切片分为4组,并进行预处理30 min(n=1):纯酸蚀作为空白对照组;纯再矿化溶液处理组;白藜芦醇组;环糊精-白藜芦醇包合物组。

室温下,将所有样品在pH=7.2的0.1 mol/L PBS中的3%GD中固定4 h,并用0.1 mol/L PBS冲洗。在上升乙醇系列(25%、50%、75%、90%、95%和100%)中脱水后干燥。用金(E-1045日立,日本)溅射涂覆处理过的样品,并用场发射扫描电子显微镜(FESEM,日立S-4800,日本)检查脱钙胶原基质的形态。

2 结 果

2.1 FTIR分析

包合物、白藜芦醇及环糊精的FTIR谱图如图1所示,在环糊精和环糊精-白藜芦醇包合物的FTIR光谱中,羟基O—H的价键振荡呈宽频带形式,环糊精和环糊精-白藜芦醇包合物最大值分别在3 405.92 cm-1和3 363.59 cm-1处。环糊精的特征峰为3 405.92-1,2 927.54-1,1 028.55-1,这些值反映了O—H和CH2的对称和非对称伸缩振动以及O—H的弯曲振动。在1 700～450 cm-1范围内,白藜芦醇的红外吸收在1 610.29、1 587.24和1 385.06 cm-1处显示出3个特征强波段,分别对应于芳香C—C双键的吸收、烯烃C—C键的吸收和C—O的吸收。典型的反式烯烃带为962.88 cm-1。包合物的FTIR光谱显示“客体”分子的光谱特征发生了变化,1 385.06 cm-1和962.88 cm-1处的谱带强度下降,而1 610.29 cm-1、1 587.24 cm-1处的谱带消失。这些变化验证了包合物的形成。

图1 白藜芦醇、环糊精及包合物红外图Fig.1 FTIR spectra of cyclodextrin, resveratrol and inclusion complex

2.2 热重分析(thermogravimetry analysis)

包合物、白藜芦醇、环糊精的热重谱图如图2所示。白藜芦醇在345 ℃时迅速发生质量损失,环糊精-白藜芦醇包合物组在342 ℃时迅速发生质量损失。并且图中显示环糊精与包合物的3个区域的质量损失。第1个区域在140 ℃左右,质量损失约15%,可能是由于与环糊精相关的表层水蒸发所致。第2阶段约为200 ℃,质量损失为2%,可能是由于内部水分蒸发所致。第3个阶段约为350 ℃时,质量损失为80%,可能与化合物降解有关。样品之间差别较明显阶段在第1和第3阶段,包合物显示出更高的热稳定性。

a:环糊精、白藜芦醇、包合物TG曲线;b:白藜芦醇TG-DTG图;c:环糊精TG-DTG图;d:包合物TG-DTG图;dw/dt是W对t的微分,代表样本质量对温度的变化速率

2.3 细胞毒性评价

将制得的包合物与白藜芦醇进行CCK8实验分析,如图3所示。白藜芦醇组在浓度为5 μg/mL时已经表现出明显细胞毒性,环糊精-白藜芦醇复合物组在10 μg/mL时才表现出明显细胞毒性。白藜芦醇经环糊精包合后,细胞毒性显著降低。

***:P<0.001,****:P<0.000 1

2.4 白藜芦醇释放标准曲线及释放度

用无水乙醇溶液为空白,在307 nm处测定吸光度值,以白藜芦醇浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线,得到回归方程为:y=0.131x-0.004 7,R2=0.999 6,结果表明白藜芦醇在0～6 μg/mL的质量浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系,标准曲线见图4。白藜芦醇7 d内总释放度为25.85%。

图4 白藜芦醇标准曲线Fig.4 Standard curve of resveratrol

2.5 SEM分析

图5A显示了脱矿牙本质表面的典型SEM图像,牙本质小管保持完全开放,管壁和牙本质小管之间的胶原纤维形态可见。纯再矿化液组(B)的牙本质小管保持开放,但在胶原纤维之间和牙本质小管内形成少量晶体,胶原形态模糊。白藜芦醇组(C)和包合物组(D)的晶体形成显著增加,胶原形态被其完全覆盖。

A:无预处理组;B:无预处理+再矿化液组;C:白藜芦醇预处理组;D:包合物预处理组

3 讨 论

白藜芦醇是多种植物受到刺激时产生的一种抗毒素,近年来被发现有多种药理活性,在临床上有广泛的应用前景。白藜芦醇为天然多酚类化合物,具有抗氧化和抗炎的特性,目前已有少量研究证明白藜芦醇与胶原有交联作用,能够维持甚至增强胶原纤维的强度,从而保护混合层的完整性[2]。这些作用主要来源于多酚中的酚羟基。白藜芦醇分子中含有3个酚羟基,因此白藜芦醇能够通过氢键对胶原纤维进行生物修饰[9]。白藜芦醇还被证实能通过抑制混合层底部基质金属蛋白酶活性,促进混合层底部仿生再矿化,提高树脂-牙本质的结合耐久性,且不会造成牙本质的染色[12]。仿生再矿化作为一种富水、树脂稀疏的胶原基质的递进脱水机制[13-15],使树脂-牙本质粘接界面能够长时间抵抗降解[6,16]。白藜芦醇的疏水性有助于在长期的水环境中排斥水分子对混合层的侵入[10]。白藜芦醇发挥作用的关键在于剂量依赖性,低剂量(0.5 μg)时呈现有益生物活性,而在高剂量时则导致细胞凋亡增加[11]。本实验运用分子包合技术,使用环糊精包合白藜芦醇,根据CCK8实验测试结果,经环糊精包合后,白藜芦醇毒性显著下降,这对于应用时可以通过增加局部浓度进一步提升白藜芦醇的生物活性是有意义的。

环糊精是在主客体化学中应用较多的主体分子,其具有疏水性空腔,并且其对药物的缓释能力已被证实[15]。包合作用可以看成是客分子取代已被包合的水分子的过程,白藜芦醇等疏水性药物容易被主体分子包合。本研究采用冷冻干燥法,按照包合比1∶1制备得到白藜芦醇-环糊精包合物,将该包合物使用傅里叶红外光谱(FTIR)、热重实验(TG)来验证包合物的形成。傅里叶红外光谱图显示,包合物的各谱峰强度明显降低或消失,物质特征峰的变化证明了包合物的形成。热重图各物质不同的温度下降区间也表明了包合物的形成。

环糊精包合白藜芦醇的目的是解决局部白藜芦醇溶解度低,生物活性不稳定[17-19]的问题,最终是期望用于牙本质再矿化的促进。通过环糊精的包裹,使得白藜芦醇能够被缓慢释放,长时间作用于脱矿牙本质,在不引起细胞毒性的情况下促进牙本质再矿化。为直观评价包合对牙本质再矿化的价值,本实验采用扫描电镜观察包合物预处理后脱矿胶原再矿化的情况,根据观察结果,对比酸蚀组及单纯再矿化组,白藜芦醇组和包合物组晶体形成显著增加,胶原形态被其完全覆盖。环糊精包合白藜芦醇后,包合物在牙本质表层缓慢释放白藜芦醇,白藜芦醇得以进入脱矿胶原的深部,促进深部胶原的再矿化。白藜芦醇是单分子、低分子量、高渗透性的化合物,可以顺利到达牙本质更深层,并利用—OH基团有效地结合到胶原纤维表面,发挥自下而上的再矿物质化作用[20-22]。