利用高通量测序检测新疆野苹果上的病毒

米美璇 张志想 李世访 战斌慧 合木提江·米吉提

关键词：新疆野苹果；高通量测序；苹果茎沟病毒

新疆野苹果Malus sieversii又名赛威氏苹果，是珍贵的野生种质资源，集中分布在我国新疆伊犁的巩留县、新源县和霍城县的野果林中。近年来，新疆野苹果的保护逐渐引起了人们的重视。然而，目前新疆野苹果上植物病毒的侵染情况仍不清楚。苹果褪绿叶斑病毒（apple chlorotic leaf spot vi-rus，ACLSV）、苹果茎沟病毒（apple stem groovingvlrus，ASGV）、苹果茎痘病毒（apple stem pitting vi-rus，ASPV）是苹果产业中最普遍的3种病毒，经常复合侵染，引发“高接病”等，致使树体终生带毒、生长衰退、嫁接不亲和，甚至死亡。为此，本研究采用高通量测序技术和RT-PCR技术，对采集自新疆伊犁野果林的野苹果样品进行了病毒检测和鉴定，检测到ACLSV、ASGV和ASPV。结合RACE末端扩增技术获得ASGV的全基因组序列并进行同源分析。该结果对新疆野苹果保护和利用提供了重要参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品采集

2021年6月，于新疆伊犁新源县和巩留县的野果林采集新疆野苹果叶片样品127份。

1.1.2主要剂

高保真酶2×TransStart FastPfu PCR Su-perMix、SMARTer RACE cDNA Amplification Kit和CTAB购自北京冰达生物科技有限公司；克隆载体CV14-2ero Background pTOPO Cloning Kit购自北京艾德莱生物科技有限公司；M-MLV逆转录酶购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；DH 5a大肠杆菌感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen试剂公司。

核酸提取所用CTAB缓冲液配制：1mol/LTris-Cl（pH 8.0）20 mL，3 mol/L NaCI 133.2mL，0.2mol/l EDTA（pH7.0）20 mL，CTAB（固体粉末）4g，灭菌水至200mL。

1.1.3引物设计与合成

本研究所选用的ACLSV、ASPV、ASGV检测引物和ASGV全基因组扩增引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1RNA提取

称取新鲜叶片0.1g，用CTAB法提取所有样品的总RNA，具体方法参考Li等。

1.2.2RNA测序文库构建、测序及生物信息学分析

将两地采集的样品各分为两组，每组由6～8份样品随机组成。将混合后的样本分别命名为S1（6份）、S2（6份）、S3（6份）、S4（8份），提取RNA。使用完整性、纯度、浓度等质量检测均合格的RNA，去除rRNA后构建文库，由天津诺禾致源生物信息科技有限公司进行高通量测序，高通量测序平台为Illumina HiSeq2000。得到测序原始数据（raw reads）后，去除接头序列、低质量和未配对测序数据；获得过滤的数据（cleanreads），将其与苹果基因组比对，去除宿主来源的数据；再使用Trinity（v2.2.0）拼接数据，获取序列重叠群（contigs）；将所得contigs在GenBank中的病毒数据库中进行BLAST检索。

1.2.3ACLSV、ASPV、ASGV的RT-PCR检测和ASGV全基因组的扩增

选取一份本研究中已鉴定为ASGV阳性的新疆野苹果样品cDNA为模板，进行ASGV全基因组序列的扩增和克隆，PCR扩增体系和克隆步骤同上，ASGV的末端扩增部分具体操作参照SMARTer⑥RACE 5'/3'试剂盒说明书。

1.2.4PCR产物克隆及测序

用凝胶回收试剂盒回收目的片段，将回收产物连人pTOPO载体，转化至DH5a感受态，后筛选阳性克隆。每种病毒随機选取2～4个阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.5ASGV全长基因组序列的一致性分析和系统发育分析

采用DNAMAN 9软件对测序结果进行拼接、组装，校正后，通过NCBI BLASTn工具在GenBank数据库中对获得的序列进行同源序列检索，用SDTv．1.2软件和MEGA 7.0软件分析ASGV-XJ分离物与已报道的其他分离物基因组间的序列（表2）一致性和亲缘关系。采用Clustal W算法对序列进行比对，邻接法（NJ）进行系统发育树构建，自展校正值为1000;并以50%为阈值显示系统发育树，樱桃病毒A（cherry virus A，CVA）美国樱桃分离物全长基因组作为外参（NC003689）。

2结果与分析

2.1高通量测序结果与分析

经高通量测序结果及生物信息学分析，4组样品中有2组检测到了病毒（表3）。从SI样品中获得了8条与ASPV同源的序列，与参考序列MZ148024.1的序列相似性为67%～94%。从S2样品中获得了1条与ASPV同源的序列，其长度为293nt，与参考序列M2148024.1的序列相似性为87.6%;1条与ACLSV同源的序列，长度为203 nt，与参考序列M2126498.1的序列相似性为93.5%。然而，获得的病毒序列较短，相应病毒基因组序列的覆盖率较低。

2.2ACLSV、ASPV、ASGV的RT-PCR检测

为进一步验证高通量测序结果，对所有新疆野苹果样品（127份）进行RT-PCR检测，均检测到ACLSV和ASPV。此外，考虑到除ACLSV和ASPV外，ASGV也是侵染苹果的常见病毒之一。因此，也检测了所有样品是否含有ASGV。总检出率分别为22%（ACLSV）、19.7%（ASPV）、11%（ASGV）（图1）。

2.3新疆野苹果上3种病毒PCR产物的序列测定及比较分析

将这3种病毒的PCR产物进行纯化和克隆、测序，将所得序列与GenBank中相关病毒的核苷酸序列和氨基酸序列进行比对，在核苷酸水平上的相似性为84%～99%，在氨基酸水平上的相似性为80%～100%，进一步证实了ACLSV、ASPV、ASGV的侵染。

2.4ASGV基因组的扩增

通过基因组的扩增、克隆和测序，获得了ASGV新疆野苹果分离物的基因组全长序列，暂时命名为ASGV-XJ。ASGV-XJ基因组的长度为6506nt，5＇和3＇非翻译区长度分别为46nt和142nt。含2个重叠的开放阅读框ORF1和ORF2。ORFI（47-6364nt）编码分子量约241kD的多聚蛋白，包括2个保守结构域，分别为复制酶区域（MTR、P-PRO、HEL和RdRp）和外壳蛋白（CP）；ORF2（4798-5760nt）编码分子量约36 kD的移動蛋白（MP）。

2.5ASGV与其他分离物间的基因组序列一致性和系统发育分析

应用SDT软件分析了ASGV-XJ与已报道的其他分离物基因组间的核酸一致性，为81.1%～90.1%，其中与ASGV中国柑橘分离物（AY646511.1）一致性最低，与ASGV中国苹果分离物（KX686100.1） 一致性最高。

应用MEGA7．0软件，基于全长基因组序列构建的进化树被分为2个组（图2）。组工包含14个分离物，可以进一步分成3个亚组，新疆野苹果分离物（ASGV-XJ）位于组工的亚组Ⅲ，ASGV-XJ与中国苹果的分离物（KX686100.1）聚在同一分支。组Ⅱ包括6个分离物，分成2个不同分支，构成2个亚组。

3结论与讨论

新疆野苹果既是非常重要的种质资源，也是一些苹果种植区常用的砧木材料，其保护和使用愈受重视。但目前主要关注苹果小吉丁虫Agrilus mali的危害，而很少考虑病毒的影响。我们发现新疆野苹果会被我国苹果上最常见的3种病毒（ACLSV、ASPV和ASGV）侵染。对ASGV新疆野苹果分离物（ASGV-XJ）基因组进行了全基因组扩增，将获得ASGV-XJ的全基因组序列与已报道的其他分离物基因组间的核酸一致性为81.1%～90.1%。系统发育分析结果表明，系统发育树分成2个组，ASGV-XJ与中国苹果的分离物ASGV-XY（KX686100.1）聚在同一分支，分离物间没有表现出寄主专一性和地理分布规律，这为新疆野苹果的保护和利用带来了重要启示。保护方面，虽然这3种病毒在苹果上通常是潜隐性的，而且在调查中也未发现明显的症状，但不能排除病毒侵染导致植株早衰，或其他病虫害更易发生的可能；利用方面，若利用带毒植株作砧木，则会造成病毒的扩散和蔓延，影响苹果生产。因此，无论是保护还是利用，均需要加强病毒的检测。此外，考虑到新疆野果林是较为独立的区域，而这3种病毒均无传毒媒介，那么本研究的结果则提出了新疆野苹果上的病毒来源问题。未来这一问题的阐明应该有助于深入了解这3种病毒的传播及进化。