小麦白粉菌环介导等温扩增检测技术体系的建立与应用

向礼波 袁斌 薛敏峰 史文琦 曾凡松 杨立军 龚双军

关键词：小麦白粉菌；环介导等温扩增；灵敏度；特异性；快速检测

白粉病是一种真菌病害，影响近10000种被子植物，其中包括许多具有重要经济意义的栽培植物，如观赏植物，果树和谷物。大多数白粉病是由子囊菌亚门Ascomycota白粉菌属Erysiphe真菌所引起，包括大约820种。谷物类白粉病是由禾布氏白粉菌Blurn.eria gra-rninis引起的，仅在禾本科的杂草和栽培谷物中发现。经济上最重要的是小麦和大麦的白粉病，小麦白粉病在世界许多降雨量大的海洋或半大陆性气候地区造成重大产量损失。病害防治的主要措施是种植抗性品种和施用杀菌剂。小麦白粉病属于气传性病害，对小麦生产的威胁主要来自于春季流行区，因此，在早春季节对菌源进行检测是开展病害预警的关键环节，也可为化学防治提供科学依据。目前生产上主要通过孢子捕捉器和植保人员田间随机调查对白粉病进行监测，但该方法费时且起不到早期预警作用，因此，在生产中急需一种实用、操作简便且快速准确的小麦白粉病菌早期检测方法。

环介导等温扩增（loop mediated isothermal am-plification，LAMP）技术是Notomi等2000年开发的一种恒温核酸扩增技术。该方法针对目的基因序列的特异性区域设计一对外部引物和一对内部引物，在具有链置换活性的Bst DNA聚合酶催化作用下，在15～60min内能够产生大量多环花椰菜结构的DNA片段混合物。该技术凭借着灵敏度高、不需要特殊和昂贵的仪器、直接在反应体系中加入染料根据颜色的变化检测等优点而备受关注。目前该技术已广泛应用于各类病原微生物、食品微生物和转基因成分的检测。

国内外已开发出多种检测白粉菌的分子方法。Mori等以核糖体DNA内转录间隔区（internaltranscribed spacer，ITS）为靶标序列设计引物将白粉菌属分成5个谱系。Zeng等用小麦白粉菌的ITS序列开发出小麦白粉菌的常规PCR、巢式PCR检测体系，并用不同地区采集的小麦白粉病样验证开发的PCR检测体系，发现巢式PCR的灵敏度高于常规PCR。Zheng等利用小麦白粉菌ITS序列筛选出特异性引物Bgt-F/Bgt-R并建立了实时荧光PCR检测体系，检测的灵敏度为0.1pg，比常规PCR高100倍，并且从接种ld的发病叶片中成功检测出小麦白粉菌。以上这些已开发的分子检测方法均是基于PCR建立的变温核酸扩增技术，仪器昂贵、操作繁复、耗时较长，不适合在基层植保站应用和推广。而针对小麦白粉菌的LAMP检测技术目前尚未见报道。本研究拟以小麦白粉菌基因组中特有效应子基因BGT96224V316-LO-CUS1725（GenBank： VCU40465.1）为靶标序列，筛选合适的LAMP引物，并建立小麦白粉菌的LAMP检测技术，旨在为准确、简便的小麦白粉病早期监测提供技术支持。

1材料与方法

1.1供试材料

本研究中所用的菌株包括10株中国小麦白粉菌，分别来自陕西（5-83，6-69）、湖北（11-61，11-99）、安徽（17-18，17-40）、江苏（21-2，24-4）、新疆（49-1，50-2）和1株瑞士小麦白粉菌（96224），共计1 1株。小麦白粉菌均采用小麦离体叶段方法进行保存和扩繁。另有7种其他白粉菌（表1），分别采集于当地生长季节发病的不同寄主植物，带回实验室用原寄主植物进行菌株扩繁。1株可培养病原真菌油菜菌核菌（表1），该菌株的活化培养采用PDA培养基（马铃薯200g/L，葡萄糖18g/L，琼脂18g/L）。

1.2DNA的提取

在PDA培养基上培养油菜菌核菌至菌丝长满培养皿，刮取菌丝至2mL的离心管中，液氮速冻后于全自动组织研磨仪研磨60s，使用基因组DNA提取试剂盒（D3195-01，Omega Bio-Tek公司）提取真菌基因组DNA。小麦白粉菌和其他7种白粉菌的样品收集方法如下：首先选取严重发病的叶片，在超净台中轻轻敲打叶片将抖落的孢子收集到2mL离心管中，再向管中加入7粒直径为5mm的玻璃珠（Sigma公司，货号18406）。DNA的提取参照龚双军等的方法进行。

1.3LAMP引物设计与合成

根据NCBI中报道的瑞士小麦白粉菌菌株96224基因组序列，依靠基因序列比对分析，选取BGT96224V316_LOCUS1725 （GenBank：

VCU40465.1）为靶标序列，利用Primer Explore 5在线软件（http：∥primerexplorer.

jp/lampv5 e/index.

html）设计引物（表2）。

1.4LAMP反应体系的特异性检测

为检测LAMP方法的特异性，分别以9种供试病原菌的gDNA为模板，以1.3筛选到的引物进行LAMP反应，以灭菌超纯水为空白对照。LAMP反应体系Betain、40 U BstDNA聚合酶，模板gDNA 1uL，灭菌超纯水补足25uL，混匀后于65℃水浴锅中反应60 min，80℃2 min进行酶灭活处理，然后向反应体系中加入1肛L钙黄绿素。使用紫外照射装置（350～370nm）从反应试管侧面进行观察。绿色荧光为阳性反应，未发荧光为阴性反应。

1.5LAMP反应体系的灵敏度检测

对提取的小麦白粉菌菌株96224基因组DNA，进行10倍梯度稀释，得到3fg/uL～3ng/uL的DNA，进行LAMP引物的灵敏度试验，以灭菌超纯水为空白对照。观察反应体系颜色的变化，方法同1.4。

1.6发病小麦叶片中病原菌的LAMP检测

为测定LAMP方法对发病叶片中小麦白粉菌的检测效果，以灭菌超纯水为空白对照，以未接种小麦叶片为阴性对照。进行如下试验设置：剪取感病品种‘Chanceller’第一叶中间部分3cm长，叶片正面朝上放在含苯并咪唑（50mg/L）的琼脂保鲜培养基上，在超净台上收集预先繁殖好的新鲜分生孢子到无菌5mL的离心管中，参考史文琦等的方法进行接种，调整白粉菌菌株96224接种浓度为10～20个/mL，然后将培养皿置于17℃，L∥D=18h∥6h光照培养箱中培养。分别在接种后2、4、8、12、24、48、96．120h和144h取样进行检测。使用植物基因组DNA提取试剂盒（D3485-01，Omega Bio-Tek公司）提取小麥组织gDNA，将其作为模板进行LAMP反应。方法同1.4。

2结果与分析

2.1LAMP引物的设计与筛选

以小麦白粉菌菌株96224的DNA为模板，用设计的3套引物进行引物筛选，结果如图1所示，只有引物Bgt-LAMP-1能够扩增出明显的梯状条带，其他引物均无条带出现。加入钙黄绿素荧光染液后，引物Bgt-LAMP-1反应液为绿色，其他引物的反应液为橙色，说明只有Bgt-LAMP-1可以用于后续特异性和灵敏性试验。

2.2LAMP反应体系的特异性

为了验证LAMP反应引物的特异性，对供试的11株小麦白粉菌菌株和8株对照菌株进行LAMP检测。在紫外灯照射下，阳性反应均为绿色荧光，阴性反应和空白对照均不发荧光。11株小麦白粉菌菌株的检测结果均为阳性，检出率为100%，而8株对照菌株无论是专性寄生菌还是腐生菌的检测结果均为阴性，没有出现绿色荧光（图2）。

2.3LAMP反应体系的灵敏度

如图3所示，以提取的小麦白粉菌96224基因组DNA为模板，10倍梯度稀释，进行LAMP反应。在紫外光照射下，阳性反应均为绿色荧光，阴性反应和空白对照均不发荧光。LAMP能检测到浓度为300fg/uL的DNA。

2.4LAMP反应体系对小麦发病组织的检测结果

提取接种小麦白粉菌2、4、8、12、24、48、96、120h和144h的小麦组织gDNA，进行LAMP反应后加入钙黄绿素，在紫外灯照射下，接种4h及以上的小麦发病组织的LAMP反应为呈绿色的阳性反应（图4）；说明该反应体系可准确从发病小麦叶片中检测到小麦白粉菌，可检测到小麦白粉菌的最早时间为侵染4h。

3结论与讨论

本研究以小麦白粉菌专有的效应子基因BGT96224V316-LOCUS1725（Bgt-2014）筛选出Bgt-LAMP-1引物对并建立了小麦白粉菌LAMP检测技术。所建立的体系特异性好，能与其他8种专性寄生菌有效区分，灵敏度达到300fg/UL，在接种后4h即可检测出小麦白粉菌，而正常肉眼观察到白粉病的症状一般在7d左右，所以该方法为田间白粉病菌的早期监测提供手段，为病害的防治提供科学依据。

预测预报技术是准确防控小麦白粉病，减少农药使用和精准施用的关键。因此，开展小麦白粉病预测预报研究，对于科学防治小麦白粉病具有重要意义。分子检测技术是预测预报的重要手段之一，可为精准的预测预报提供分子技术方案。目前已成功建立了普通PCR、巢式PCR和荧光定量PCR检测小麦白粉病的方法，尚没有文献报道有关LAMP技术在小麦白粉病上的研究。LAMP检测方法多数是以真菌通用ITS序列作为靶标，笔者前期根据小麦白粉病菌ITS序列设计的1对内引物和1对外引物建立的小麦白粉病菌LAMP检测体系，不仅能夠检测到小麦白粉病菌DNA基因组，同样也能够检测到大麦、黄瓜和草莓等其他植物白粉病菌DNA基因组，特异性较差。而且ITS已被证明不足以区分白粉菌的种，而一些持家基因，如肌动蛋白（actin）基因，钙调蛋白（calmodulin）基因，微小染色体维持蛋白（minichro-mosome maintenance）基因等，在解决这一问题上被证明具有重要的应用价值。本研究使用以小麦白粉菌特有的效应子基因BGT96224V316-LOCUS1725（Bgt-2014）全长序列设计筛选出Bgt-LAMP-1引物对，特异性较好，可用于建立小麦白粉病菌LAMP检测体系。本研究的LAMP技术从接种小麦白粉菌2h的小麦叶片中未能检测到阳性结果，分析原因可能是接种后2h这一阶段仍是接种的分生孢子，接种孢子浓度过低所以检测不到；小麦白粉菌分生孢子萌发需要4h左右，此时形成初生芽管并缓慢伸长，小麦叶片中小麦白粉菌的生物量增多达到检测限，所以接种后4h可以检测到。

本研究建立的小麦白粉菌LAMP检测方法虽然简便快速，但仍然很难用于田间地头的现场检测，主要是核酸提取过程需要特殊的仪器，例如必须使用离心机，并且步骤较多，所需时间较长。下一步将从DNA提取方面优化该检测方法。目前正在尝试使用Chelex-IOO提取小麦叶片的DNA，该方法加入碱提取液研磨后直接吸取上清液用于扩增反应，不使用离心机且提取时间仅为60min；目前使用的核酸染料钙黄绿素是一种自发光荧光染料，在日光下可以自然发出黄绿荧光，方便观察结果。经过以上的优化后，小麦白粉菌LAMP检测方法将更加简便快速，使基层的植保工作者能够直接在田间地头开展工作。