多重RT-PCR同时检测6种马铃薯病毒及1种类病毒

邹莹 杨立杰 谢锦 赵冀 毕恒翊 陈火云 宋波涛 马恢 聂碧华

关键词：马铃薯；病毒；类病毒；检测方法；多重RT-PCR

马铃薯是世界第三大粮食作物，也是我国重要的农业经济作物。但马铃薯易受到多种病毒病危害，加之其繁殖方式为无性繁殖，容易发生退化而导致产量和品质严重下降。已报道能在田间侵染马铃薯的病毒和类病毒有60多种，其中马铃薯Y病毒（potato virus Y，PVY）、马铃薯X病毒（potato virus X，PVX）、马铃薯A病毒（potato virus A，PVA）、马铃薯M病毒（potato virus M，PVM）、马铃薯S病毒（potato vi-rus S，PVS）、马铃薯卷叶病毒（potato leaf roll vi-rus，PLRV）这6种病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒（potato spindle-tuber viroid，PSTVd）是我国流行的主要种类。由于缺少有效的药剂清除侵入寄主细胞内的病毒，当前，马铃薯病毒病防治主要使用脱毒种薯，而在脱毒种薯生产过程中，对主要病毒和类病毒进行快速、准确的检测是保证种薯质量的关键，因此，建立高效的病毒检测方法对病毒病的防治具有重要意义。

酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosor-bent assay．ELISA）是应用广泛的病毒检测方法，具有特异性强、灵敏度高、可一次性检测大量样品等优点，但该方法一次只能检测一种病毒，无法检测类病毒PSTVd，对病毒浓度较低的马铃薯块茎样品也有一定的局限性。反转录一聚合酶链式反应（re-verse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR）检测技术具有简单快速、特异性强、灵敏度高等优点，并且可以弥补ELISA检测方法的不足。尤其是多重RT-PCR可以同时检测多种目标病毒，可大大提高检测效率。Peiman等利用多重RT-PCR技术从PVX、PVS和PLRV单独或复合侵染的样品中检测出这3种病毒。罗文彬等建立了可同时检测PVX、PVM、PVY、PVA和PVS的多重RT-PCR技术。Lorenzen等和Mallik等利用免疫捕捉多重RT-PCR检测和鉴别了马铃薯Y病毒的5种主要病毒株系。但多重RT-PCR并非RT-PCR简单的组合，其对各引物的特异性、匹配性有很高的要求，还要求各引物之间没有互作，引物自身不形成二级结构，各引物退火温度相近，扩增片段电泳能够区分开等。因此，检测的目标片段越多，建立多重RT-PCR难度也越大。能够一次性检测我国主要流行的全部6种病毒（PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PLRV）和一种类病毒（PSTVd）的多重RT-PCR检测体系迄今尚未见报道。本研究建立并优化了可同时检测PVX、PVY、PVS、PVM、PVA、PL-RV、PSTVd的多重RT-PCR检测体系，为脱毒种薯生产和病毒病的防治提供重要的技术支撑。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1病毒及樣品

6种主要病毒（PVX、PVS、PI。RV、PVA、PVY、PVM）和1种类病毒（PSTVd）单独侵染的马铃薯试管苗，在（20±2）℃，光周期L∥D=16h∥8h的培养室中培养并保存，试验前用ELISA或RT-PCR确认上述材料中病毒的种类和感染的唯一性。此外，从田间种植的马铃薯高代系材料中收集了26份有疑似病毒病症状的马铃薯叶片样品用于多重RT-PCR方法的验证。所有RT-PCR检测均以马铃薯脱毒组培苗作为健康对照。

1.1.2主要试剂

本试验ELISA所用马铃薯病毒检测试剂盒购自英国ADGEN公司；UNIQ-10柱式TRIzoI总RNA抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、6bp的随机引物、PCR特异引物均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；质粒小量提取试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.2方法

1.2.1总RNA提取及cDNA合成

取马铃薯叶片0.1～0.3g，采用UNIQ-10柱式TRIzoI总RNA抽提试剂盒提取叶片总RNA。20uL的cDNA合成体系含1ug总RNA、2.5pmol/L的6bp随机引物、1.0mmol/L的dNTPs、4uL 5×M-MLV缓冲液、1.25U/uL的反转录酶、0.5U/uL的RNA酶抑制剂。总RNA与随机引物混合后先在65℃变性5min，立即置于冰上冷却2min，再加入其余组分在PCR仪中42℃反应90min，最后70℃灭活反转录酶15min。

1.2.2引物设计与筛选

首先从参考文献中筛选获得PVY、PVS、PVX、PSTVd及Cox工的特异性引物，然后依据产物不超过700bp，且与上述目标产物大小容易区分的原则，进行PLRV、PVM和PVA特异性引物的设计。先在NCBI上分别检索这3种病毒的全长核苷酸序列、外壳蛋白核苷酸序列及P1蛋白核苷酸序列，使用Clustal 2.0及GeneDoc进行比对，再利用Primer Premier 5.0设计引物，引物信息见表1。通过本实验室Peiman等建立的单重RT-PCR体系，用各病毒阳性材料的cDNA验证引物的特异性。

1.2.3多重RT-PCR检测体系的建立和优化

本实验室Peiman等已建立了可同时检测PVX、PVS、PVY、PLRV、PSTVd的五重RT-PCR检测体系，本研究在此基础上增加了PVM、PVA和内参基因Cor-工的特异性引物，同时基于产物大小能通过电泳区分的原则，用自主设计的PLRV引物和吕典秋等设计的PSTVd引物将原体系中的对应引物进行了替换，建立了总体积50uL。的八重RT-PCR反应体系，并对镁离子、dNTPs、cDNA模板以及引物浓度进行了筛选。各因素终浓度设置如下：MgC12溶液（200、250、300 umol/L），dNTPs溶液（240、280、320 umol/L），每种病毒质粒模板（14、21、28ng/uL），各种病毒特异性引物（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6umol/L）。

1.2.4PCR产物的克隆和测序

PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后采用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收目的片段。回收产物与pMD18-T载体在16℃下连接过夜，连接产物转大肠杆菌DH5a菌株，进行蓝白斑筛选，挑取阳性单菌落转移至20mL LB培养基中，150r/min、37℃培养过夜，菌液送至上海桑尼生物技术公司进行测序，测序获得的核苷酸序列通过与NCBI数据库进行比对，完成对病毒序列的确认。

1.2.5质粒提取及灵敏度检测

使用质粒小量提取试剂盒提取质粒，用分光光度计测定各病毒质粒的浓度，并调整到相近浓度，然后将各病毒质粒溶液等体积混合。将该混合质粒按照1：10、1：102、1：103、1：104、1：10s、1：106、1：107比例稀释后作为模板，用所建立的八重RT-PCR体系扩增，观察电泳结果，分析该八重RT-PCR检测体系的灵敏度。

1.2.6利用建立的八重RT-PCR体系对田间样品进行检测

为了验证建立的RT-PCR体系，从田间收集26份马铃薯叶片样品采用本研究建立的多重RT-PCR进行检测。同时，每份叶片样品取0.1g采用马铃薯病毒ELISA检测试剂盒检测PVY、PVM、PVS、PVX、PVA和PLRV．用单重RT-PCR检测PSTVd进行验证。

2结果与分析

2.1引物的特异性

以相应的病毒阳性材料cDNA模板进行单重RT-PCR扩增以验证引物的特异性。各病毒和Co-工基因的扩增结果如图1所示，PVY、PVM、PVS、PVX、PVA、PLRV、PSTVd和Co-工的扩增产物片段大小依次为181、226、275、565、630、681、359 bp和500bp。

为进一步验证自主设计的扩增PLRV、PVM、PVA的引物和引自文献的扩增PSTVd引物的特异性，对它们的扩增产物进行了回收纯化及测序，将测序结果与GenBank上公布的相应病毒序列进行核苷酸序列比对。结果显示，PLRV、PVM、PVA和PSTVd的扩增产物与相应病毒、类病毒参考序列一致性分别达98.7%（EU717546）、98.5%（HM991708）、99.8%（249088）和98.5%（EU879923），表明上述相应引物能成功扩增相应的病毒和类病毒目标片段。

上述结果表明，本研究设计和选择的相关引物RT-PCR扩增效果良好，产物大小易于区分，同时具有较好的特异性，可以用于后续多重RT-PCR体系的构建。

2.2多重RT-PCR检测体系的优化结果

用不同病毒及类病毒cDNA混合物作模板，以来自马铃薯脱毒苗的cDNA作健康对照，利用上述建立的多重RT-PCR检测体系，对上述8對引物中的部分或者全部进行组合，以评估多重PCR的检测效果。结果如图2所示，在所有多重PCR体系中Cox工都获得了较好的扩增。在简单组合中，PVY、PVM、PVS和Coz工的4对引物能分别与PSTVd、PVX、PVA和PLRV中的任意一对引物组成扩增效果良好的五重PCR体系（图2，泳道1～4）。在PVY、PVM、PVS、Co-工和PLRV组成的五重PCR的基础上，进一步增加PSTVd、PVX、PVA中的一种，可组成六重PCR体系（图2，泳道5～7），而增加其中的两对引物还可以成功地进行七重PCR扩增（图2，泳道8～9）。最后，所有8对引物也能完成同体系扩增反应，各产物能够从大小上进行区分，具有较好的检测效果（图2，泳道10）。

2.3多重RT-PCR的灵敏度

进一步用各目标病毒的质粒进行灵敏度分析，将含PVX、PVY、PVA、PVS、PVM、PLRV、PSTVd浓度分别为190.73、168.91、158.08、178.37、176.09、180. 04ug/uL和174. 71ng/uL的质粒模板等体积混合后进行梯度稀释，检测结果如图3所示。模板稀释103后，所有目标病毒和类病毒仍然能够获得清晰的特异性扩增条带（图3，泳道1～4）；稀释104后，多重RT-PCR还能检测到PVA、PVX、PSTVd和PVY（图3，泳道5）；稀释105后，多重RT-PCR只能检测到PVA和PVX（图3，泳道6）；进一步稀释到106、107后，多重RT-PCR检测不到任何特异扩增条带（图3，泳道7～8）。由此可见，该多重RT-PCR反应体系对各种病毒和类病毒的检测限有所差异，其中PLRV、PVS和PVM病毒能检测到的最低浓度约为1.8×10-1 ng/uL，PVY和PSTVd能检测到的最低浓度约为1.7×10-2 ng/uL，而对PVA和PVX病毒的检测最为灵敏，能够检测到的最低浓度分别为1.6×10-3ng/uL和1.9×10-3ng/uL。

2.4田间样品的病毒检测结果

从大田收集了26份疑似感染病毒的马铃薯样品，用本研究建立的多重RT-PCR体系进行检测，同时用DAS-ELISA方法检测6种马铃薯病毒，用单重RT-PCR检测PSTVd，对建立的多重RT-PCR体系进行验证。检测结果显示，所有样品用多重和单重RT-PCR两种方法检测均未检出类病毒PSTVd，而其余6种马铃薯病毒的多重RT-PCR与DAS-ELISA检测结果完全一致（图4），同时本研究建立的多重RT-PCR方法对PVY、PVM、PVS、PVX的检出率均高于DAS-ELISA检测，其中，多重RT-PCR还检测出DAS-ELISA未检测出的PVS病毒3例（图4，泳道4，9，16）、PVY病毒1例（图4，泳道2）、PVX病毒2例（图4，泳道2，7）以及PVA病毒1例（图4，泳道12）。部分检测结果见图4，表明本研究建立的多重RT-PCR检测结果较DAS-ELISA灵敏度更高，可以应用于田间样品的检测。

3结论与讨论

近年来，RT-PCR因具有快速、灵敏、特异性强等优点，在马铃薯病毒检测中得到了较好的应用，尤其是多重RT-PCR检测技术，能够实现在一个反应中同时检测多种病毒，检测效率更高，操作更简便，被广泛研究和应用。本研究建立和优化了能同时检测PVX、PVY、PVA、PVS、PVM、PLRV及PSTVd的多重RT-PCR检测体系，是至今为止一次性检测种类最多的方法。同時，本体系引入了马铃薯内源参考基因Co-工，可有效避免由于RNA降解或其他RNA质量问题导致的假阴性问题，使得该多重RT-PCR检测体系更加严谨和完善。

引物的设计和筛选是多重RT-PCR体系建立的关键。引物要具有特异性，引物间退火温度应接近，相互影响应较小，其扩增的目标片段又要易于区分，同时还要避免各目标片段差异过大对扩增效率及延伸时间造成影响，合理地选择引物会使反应体系更容易被优化，本研究针对PVA，PVM和PLRV CP基因的保守核苷酸序列分别设计特异性引物，同时遵循以上引物组合的基本原则，应用单重RT-PCR体系对自主设计和文献查找获得的引物进行验证，确定了该多重RT-PCR检测体系中7种病毒／类病毒的最佳引物组合。反应体系和反应条件是影响多重RT-PCR扩增效果的两大类因素，建立准确且稳定的多重RT-PCR检测体系需要对影响多重RT-PCR反应的主要条件及反应程序进行单因子优化。张威等对所建立的三重RT-PCR进行优化的试验结果表明，适当提高MgC12和dNTPs的浓度有利于提高扩增效率，但也并非越高越好，因为dNTPs会与溶液中的Mg2+结合，而TaqDNA聚合酶发挥活性需要游离的Mg2+，因此溶液中MgC12和dNTPs的浓度要保持一定的平衡，本研究优化的试验结果与其相符，本研究结果表明，为使体系扩增效率最高，需保证有足够量的dNTPs，当dNTPs浓度为达320umol/L时，扩增效果最佳，而MgC12过高或者过低都会影响体系的扩增效果，当其浓度为250umol/l。时所扩增的目的条带最清晰。董代幸等对所建立的四重RT-PCR进行了优化，结果表明，各引物对的浓度和比例不当会使某些目标条带扩增不出来或者产生非特异性扩增，同时，由于各目标片段大小不同，各引物的特异性也存在差异，引物浓度与相应模板的量也需要进行反复探究，本试验遵循以上原则对各引物对的浓度、比例以及相应模板量进行优化，获得了最佳扩增效果的各引物及模板用量。

特异性和灵敏度是评价多重RT-PCR体系的重要参数，引物特异性强、灵敏度高才能保证检测结果的准确性。为了探究多重RT-PCR的灵敏度，本试验将各病毒质粒模板混合并进行一系列稀释后进行反应，结果显示，各病毒／类病毒的最低检测浓度在1.6×10-3～1.8×10-1ng/uL之间，说明该检测体系灵敏度较高；另外，应用本研究建立的多重RT-PCR体系对26个不同品种（系）的田间样品进行检测，结果表明，该多重RT-PCR检测体系比DAS-ELISA检测的灵敏度高，可检测出DAS-ELISA无法检测出的感病情况。

本试验首次实现了PVY，PVS，PVM，PVX，PVA，PLRV、PSTVd的同时检测，突破以往多重RT-PCR检测技术检测病毒数量少的局限，且以马铃薯内源性参考基因（Cox）作为对照，保证了检测结果的可靠性，经本试验验证，该体系可降低检测成本，提高检测效率，可用于马铃薯种薯质量检测。