影响红鳍东方鲀生长性状的候选基因及其SNP的研究进展

薛 雨,王秀利

(大连海洋大学水产与生命学院,辽宁 大连 116023)

红鳍东方鲀(Takifugurubripes)是暖水性海洋底栖鱼类,分布在北太平洋西部,在我国各大海区都有捕获。红鳍东方鲀肉鲜味美、营养丰富,脂肪含量低,含有丰富的维生素B1、B2以及硒、锌等多种微量元素,因此被誉为“鱼中之王”。在中国养殖的众多河鲀种类中,红鳍东方鲀是个体最大、经济价值较高的品种之一,但仍面临着种质退化的问题,部分企业河鲀亲鱼长期使用,加上水质下降、品种杂交等问题使种质资源退化,直接使河鲀养殖周期变长,导致养殖成本增加[1]。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是由单个核苷酸发生变异而引起在基因组水平上的DNA序列多态性,包括单个碱基的颠换、转换、插入和缺失[2]。根据在基因组上的分布位置不同,SNP可以分为基因编码区SNPs (cSNPs)、基因间SNP (iSNPs)、基因周边SNP (pSNPs),其中cSNPs和pSNPs会对基因表达产生影响[3]。根据对生物遗传性状的不同影响,cSNPs包括两种方式:同义突变(编码序列变化不影响翻译后氨基酸的序列)和非同义突变(编码序列变化会影响翻译后氨基酸的序列变化,改变蛋白质的生物学功能)[4-6]。SNP具有遗传稳定性高、位点丰富且分布广泛、富有代表性、二态性和等位基因性以及检测快速(易实现自动化)等特点[7]。

作为第三代分子标记技术,SNP已被广泛应用于其他物种。生长性状包括体长、体重和体高等,为红鳍东方鲀最为重要的经济性状,直接影响到经济效益的高低[8]。调控红鳍东方鲀生长的特定基因,主要由三部分组成:编码氨基酸的外显子、非编码内含子以及驱动转录的启动子,当任意一部分核酸序列发生插入、缺失、替换等变化时,都可能影响(上调/下调)基因或上下游基因的表达水平甚至改变基因编码蛋白的结构和活性[9],使红鳍东方鲀的生长发育受到影响。部分研究者已经发现在一些与红鳍东方鲀生长相关的候选基因中存在着与生长发育具有显著相关性的单核苷酸多态性位点(SNP),如生长激素释放激素GHRH基因、肌细胞生成素MyoG基因等。

1 生长轴GHRH/GH/IGF-1相关基因

对于生长而言,主要的内分泌途径是垂体在生长激素释放激素(growth hormone-releasing hormone,GHRH)的诱导下分泌的生长激素 (Growth Hormone,GH)与靶器官表面的生长激素受体 ( Growth Hormone Receptor,GHR)结合后激发肝脏分泌类胰岛素生长因子1 (Insulin -like growth factor 1,IGF-1),即GHRH-GH-IGE-1轴[10]。

1.1 生长激素释放激素基因(ghrh)

GHRH是胰高血糖素超家族的成员之一,其主要功能是通过与垂体前叶的GHRHR结合来刺激GH的合成和分泌[11]。除此之外,GHRH还具有促进动物生长发育,参与免疫系统调节、细胞增殖分化等生物学过程的功能[12-14]。

在斑马鱼 (Daniorerio)等鱼类研究中发现,与大多数脊椎动物相同,ghrh基因由5个外显子和4个内含子组成[15]。在红鳍东方鲀的研究中,王梓祎等[16]用直接测序法在红鳍东方鲀的ghrh基因上筛选到了7个SNP位点,分别为C18T、G315C、C1083T、A1524G、G2017A、T2125C、G2256A,并在其中筛选出3个与大多数生长形状具有显著关联性的三个位点。在其他水产动物的研究中,Tao等[17]在北极红点鲑(Salvelinusalpinus)含有ghrh的基因位点上筛选到1个与早期生长之间存在显著相关性的SNP位点。张世勇等[18]利用DNA混池测序法在斑点叉尾鮰 (Ictalurespunctatus)的ghrh基因内含子上检测到4个SNP位点,经过筛选发现其中3个位点与生长形状存在显著的相关性。Guo等[19]通过高通量测序技术在半滑舌鳎 (Cynoglossussemilaevis)的ghrh的关联图谱上发现了2个与生长相关的SNP位点。

1.2 生长激素基因(gh)

GH是一种由脑垂体合成分泌的多肽蛋白,是垂体前叶的激素之一。鱼类GH是由鱼类脑垂体合成和分泌的一种多肽蛋白,对鱼类的生长发育起着促进作用,参与并影响着鱼类的多种代谢。黄军[20]参照GenBank数据库中红鳍东方鲀和其他近缘物种的生长激素序列,构建了东方鲀生长激素基因的进化树,运用PCR电泳检测和克隆测序技术在暗纹东方鲀、红鳍东方鲀和星点东方鲀的gh基因的intron2、intron5以及3’非翻译区发现了多处包括碱基缺失、插入和一些单核苷酸突变。王沈同等[21]利用直接测序法从草鱼的GH基因的3’部分序列中筛选到了9个SNPs,其中G2914T、T2966G位点的多态性对草鱼的早期生长存在显著的影响。谭新等[22]通过直接测序等方法在鳙gh基因的第二个内含子上发现了5个变异位点,最终筛选到C982T位点与鳙的生长性状相关性显著。鲁双庆等[23]采用长段PCR及T-A克隆技术在对三种鳜鱼的gh基因进行比较时发现了大量SNP位点。

1.3 类胰岛素生长因子-1基因(igf-1)

IGF-1是一种单链多肽,其进化上高度保守,结构上与胰岛素原同源,在脊椎动物的生长发育过程中发挥着重要作用[24]。鱼类IGF-1的mRNA主要表达在肝外组织如鳃、脑、生殖腺等中,由成体鱼类肝脏合成[25]。于海龙等[26]通过序列的多重比较在红鳍东方鲀的igf-1基因中发现了2个SNPs(T756A、G1116C),且两个突变均发生在非编码区,又通过关联分析发现该基因的T756A突变位点基因型与红鳍东方鲀的部分生长性状具有极显著的相关性。阮瑞霞等[27]分析了不同基因型与生长性状的相关性,在吉富罗非鱼igf-1基因中发现了2个SNPs,其中位于内含子1上的A1307G突变位点仅与雌鱼的生长性状具有相关性,而位于内含子3上的C6T突变位点除了在增重方面对雄鱼和雌鱼具有不同程度的显著相关性外,在其他生长性状中此位点仅与雌鱼存在显著相关性。

2 调节肌肉生长

2.1 生肌调节因子家族

肌肉调节因子 (myogenic regulatory factors,MRFs)基因家族编码4种肌肉特异性转录因子,分别是MyoD、MyoG、Myf5和Myf6,它们是生成骨骼肌的关键调节因子,相互协作,调控肌肉的生成[28]。

其中,肌细胞生成素(myogenin,MyoG)基因对肌肉的基因转录、肌细胞生长周期以及肌细胞的分化起调节作用。生肌决定因子(Myogenic determinant,Myf6)基因的编码产物可诱导成肌细胞分化融合成肌管[29]、促进肌纤维的形成并且维持肌肉的表型[30]。于海龙等[26]通过序列的多重比较在红鳍东方鲀的myog基因中发现了2个与生长显著相关的SNP突变位点 (C434T、T617A),其中C434T发生在外显子上,且为同义突变,而T617A处在非编码区。同样的,在红鳍东方鲀的myf6基因中也发现了1个与生长相关的SNP位点(G113T)为同义突变。

2.2 肌肉生长抑制素基因(mstn)

肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因能抑制MyoD家族成员转录活性负调控肌细胞的生长发育,其表达量与肌肉重量的变化呈反向变化[31]。Ying Wang等[32]通过DNA测序在mstn基因中发现2个SNP(A748G、C119T),分别位于第二外显子和第二内含子。

3 调节食欲和能量代谢

3.1 黑素皮质素受体4基因(mc4r)

鱼类黑素皮质素受体4(melanocortin receptor4,MC4R)有其独有的机制实现对能量平衡的调控。当黑素皮质素系统激活MC4R相关信号途径时,对鱼类摄食起到抑制作用,Wan等[33]发现对鲤进行饥饿处理可以让鲤脑中mc4r及其他能量平衡调控基因表达量发生显著减少, 且恢复摄食后显著迅速回复。张丽等[34]通过对红鳍东方鲀的mc4r基因的同源性比较发现了与生长性状相关的2个SNP位点(G48A、G264A),且G264A为同义突变。

3.2 脑型脂肪酸结合蛋白基因(b-fabp)

有研究发现,脑型脂肪酸结合蛋白的表达情况与中枢神经系统的发育以及神经细胞的分化可能具有相关性35],利用原位杂交发现,在斑马鱼发育早期,脑型脂肪酸结合蛋白(Brain fatty acid- binding protein,B-FABP)基因在其中枢神经系统高度表达[36]。杨晓等[37]利用重测序技术对红鳍东方鲀群体进行SNP筛选,在b-fabp基因上共发现3个与生长性状具有相关性的SNP位点(C442T、G676A、A731C),其中C442T位于第二外显子上,G676A和A731C位于第三内含子上。

4 调节骨骼生长

结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)可促进细胞增殖、促进血管生成、促进伤口愈合、促进软骨发育和骨骼发生,在生物的多种组织和器官中能广泛表达。周金旭等[38]通过多重比较在红鳍东方鲀的ctgf基因上筛选到了14个SNP位点,其中与生长具有显著相关性的SNP位点分别为C23T、G39T、C270G,且3个SNP位点皆为错义突变。

5 prkca、pacap、kras、insr、rheb等基因

prkcp为胰高血糖素家族,prkca不但与生长相关,还在细胞过程中发挥着一定的调节作用。kras在细胞增殖的调节中起重要作用。kras能生成一种蛋白质,作为信号指令参与细胞生长、分裂和增殖并承担分化等特殊功能。insr除了结合胰岛素、胰岛素受体还可以结合胰岛素样生长因子(IGFI和IGFⅡ)。rheb是一种蛋白质编码基因。与RHEB相关的疾病包括半巨脑畸形和结节性硬化症。王梓祎[39]运用全基因组测序检测出的67个与红鳍东方鲀体质量和体长极显著相关的SNP位点,并进行基因注释和验证,最后通过实验总结及查阅文献初步确定,prkca(NC 042291. 1,14965050)、pacap(NC 042306. 1,5049379)、kras(NC 042293.1 7196736)、insr(NC 042304. 1,9589878)、rheb(NC 042306.1 3602613)基因及位点可能与生长相关。

6 结束语

随着生物技术的发展,SNP标记已受到各国研究者的广泛关注,成为分子领域研究的焦点。在关于筛选与红鳍东方鲀生长性状相关SNPs的研究中,对已被识别的候选基因与生长性状进行关联分析并深度挖掘出其中存在的SNP位点,已成为目前筛选分子标记应用最为广泛的方法。目前,在影响红鳍东方鲀生长性状相关基因的研究中,大部分基因都与肌肉生长调控因子家族和生长轴相关,且筛选出的生长显著相关的SNPs位点位于外显子、内含子、5′调控区、3′调控区上。红鳍东方鲀产业方兴未艾,找到与体长、体重、肌肉生长和骨骼发育相关的 SNPs位点和疑似与之相关的候选基因,为红鳍东方鲀的分子标记辅助选育提供更多的科学依据。