河流疏浚底泥余水的固定化微生物处理技术

2023-12-27王献昆田志超赵志荣何诗诗余艳鸽辜晓原翟德勤郑茂盛

工业水处理 2023年12期

王献昆，田志超，周南，赵志荣，何诗诗，余艳鸽，辜晓原，翟德勤，郑茂盛

（1.中电建生态环境集团有限公司，广东深圳 518102；2.华北电力大学环境科学与工程学院，北京 102206）

随着经济的发展，大量污染物随着工农业生产等人类活动排入河流，沉积于河道底泥中，因此底泥富集了营养盐、重金属、有机物等各种有害物质。当河水中污染物浓度较低时，底泥将随着河水的流动持续向水体中释放污染物质，成为河道的内源污染源〔1〕。通过疏浚方式清理河道污染底泥是河道治理的主要手段之一，通过底泥清淤结合沿河截污、补水工程等措施能够有效降低重度黑臭水体断面占比，或将黑臭水体级别降为轻度黑臭。然而在疏浚底泥的过程中会产生大量余水，若处理不当会造成二次污染〔2〕。目前，国内主要通过堆场自然脱水方式来降低疏浚底泥的含水率，而对于大量疏浚底泥余水的处理，往往仅经简单的絮凝沉淀而未做进一步处理，即就近排入附近的受纳水体，从而造成二次污染〔3-4〕。

生物法以其投资低、效益高、无二次污染且运行管理方便等优势得到了快速发展，并逐渐应用到水环境污染治理中〔5-6〕，其中固定化微生物技术作为新兴技术，其采用物化的方式将微生物固定在相应载体中，使其在特定空间内高度富集，从而实现对污水的有效处理〔7〕。固定化微生物技术因其处理效率高、反应速度快、微生物流失少等特点得到广泛应用，但利用固定化微生物技术处理疏浚底泥余水却鲜有报道〔8-10〕。

笔者以广东省某河道治理项目的疏浚底泥余水为研究对象，基于固定化微生物技术，设计多级接触氧化一体化装置开展中试研究，其中采用亲水聚氨酯基填料作为微生物载体，高效去除余水中的氨氮和总氮等；同时基于分子生物学研究方法，对装置各级反应池中的微生物群落结构和功能进行分析，为进一步提升处理效能及实际工程应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验装置

本试验中多级接触氧化一体化装置的工艺结构如图1 所示。整个装置尺寸为6.0 m×2.4 m×2.2 m，有效工作容积为15.0 m3，分为5 级反应池，每级反应池的工作容积约3.0 m3，其中前两级为缺氧池，后3级为好氧池，出水进入清水池，其中在清水池中设有回流泵，可通过管路回流至第1 级底部。好氧反应池底部中央放置曝气盘，通过鼓风机向反应池内曝气，每级反应池出水堰高度沿水流方向逐渐降低，并在清水池设置出水口。该一体化装置前端设有调节池和絮凝沉淀池，经过预处理后的水作为该装置的进水进入第1 级反应池。

图1 多级接触氧化一体化装置Fig.1 The multistage contact oxidation integrated equipment

1.2 试验装置的启动与调试

试验装置的启动分为3 个阶段，分别为闷曝阶段、间歇进水阶段和提高负荷阶段〔11〕。

1）闷曝阶段。向装置中添加亲水聚氨酯基填料，将3 000 mg/L 的某污水处理厂污泥加入至每个生化池中，同时为强化系统的反硝化功能，以150 g/m3的投加量向前两级反应池中加入好氧反硝化菌剂Pseudomonas stutzeri，控制曝气量为7 m3/h，连续闷曝2 d〔12-13〕。

2）间歇进水阶段。每天按设计流量（50 m3/d）的50%缓慢泵入一倍反应池体积的水量，逐步替换掉上一阶段的进水，如此间歇运行4 d。

3）提高负荷阶段。分别按设计流量的20%和50%连续进水2 d，之后开始以设计流量连续进水，完成挂膜启动〔14〕。

在系统启动后的调试中，在确保出水水质达标的前提下，通过控制风机的曝气量尽可能降低工艺能耗，运行稳定后每级好氧池的曝气量维持在1.8 m3/h。在运行第30 天，向第1 级反应池底部以一定速率连续补加质量浓度为60 g/L 的乙醇（换算成CODCr为40 mg/L），同时开启回流装置，回流比为50%，考察系统对总氮的去除效果。

1.3 水质指标及检测方法

反应器运行期间，每天定时取样。在达到稳定运行之后，从每级反应池取样分析各污染物的沿程分布。氨氮、总氮、CODCr采用国标方法测定（GB 7479—1987、GB 11894—1989、GB 11914—1989），溶解氧（DO）采用便携式溶氧仪现场测定。根据运行期间的取样分析，系统进水平均氨氮为（12.27±4.12） mg/L，总氮为（15.74±4.48） mg/L，CODCr为（50.32±22.09） mg/L。进水碳氮比仅为3.20，且进水中难生物降解有机物含量较高，导致进水中生物可利用碳源严重不足。

1.4 DNA 提取和实时定量PCR

通过分子生物学研究方法对装置中功能微生物的丰度和群落多样性进行取样分析检测。在工艺稳定运行后对每级反应池中的微生物填料样品进行采集，然后低温保存并迅速运回实验室，采用土壤DNA 快速提取试剂盒（MP Biomedicals，USA）对样品中的总DNA 进行提取，通过NanoDrop 光度计ND-2000 对DNA 浓度和纯度进行测定。分别以特异性引物338F/806R、Arch amoA 19F/616R、amoA 1F/2R、comamoA AF/3R9、Ps 136F/598F 对样品中的总细菌、氨氧化古菌（AOA）、氨氧化细菌（AOB）、完全氨氧化菌（CAOB）以及P.stutzeri菌进行定量PCR 扩增〔15-17〕，以引物narG1960m2F/2050m2R、napAV17F/4R、nirScd3aF/R3cd、cnorB2F/6R、nosZ1527F/1773R对周质硝酸还原酶基因、膜质硝酸还原酶基因、亚硝酸还原酶基因、一氧化氮还原酶基因、一氧化二氮还原酶基因进行扩增〔18〕。定量PCR 在Applied Biosystems 7500 系统中进行，并采用20 µL 反应体系，包含10 µL 2×SuperReal Premix Plus、0.5 µL 正向和反向引物、2 µL 50×Roxpreference 染料、5 µL 无RNase H2O 和2 µL 模板DNA。使用相应基因克隆后的标准质粒经过10 倍梯度稀释后作为模板制作标准曲线。每个样品设置3个平行，并以无菌水代替模板DNA做阴性对照。

1.5 微生物群落分析

利用515FmodF/806RmodR 引物对样品中总细菌进行高通量测序分析。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳确认后，在Illumina MiSeq 平台上进行测序，测序后利用QIIME 软件对原始序列进行过滤和筛选〔13〕。利用USEARCH（Version 1.8.0）将剩余序列划分为不同的操作分类单元（Operational Taxonomic Units，OTUs），相似性阈值为97%，并通过Greengenes GG_13_8 数据库进行物种注释。利用MEGA 7.0 软件采用邻域连接（Neighbor-joining，NJ）法对CAOBamoA基因进行系统发育分析。通过使用Galaxy web 在线平台进行PICRUSt 功能预测潜在的微生物功能〔19〕。通过对氮循环相关功能基因的预测，评估各级生物接触氧化池的氮循环相关生物功能活性。

2 结果与讨论

2.1 固化微生物技术对氨氮和总氮的去除效果

试验装置调试完成后开始正式试验，水处理量维持在50 m3/d，装置进出水氨氮和总氮变化见图2。

图2 装置进出水氨氮（a）和总氮（b）的变化Fig.2 Variations of influent and effluent ammonia（a）and total nitrogen （b）

由图2 可以看出，装置的进水氨氮处于5.95～20.31 mg/L，装置出水氨氮在0.13～4.06 mg/L，出水氨氮平均值为1.02 mg/L，平均去除率达到91.21%。在进水氨氮波动较大的情况下，保持了稳定的氨氮去除效果，表现出良好的抗冲击能力。

系统进水总氮在8.33～25.00 mg/L，在运行的前30 d，由于进水中有机物含量较低，系统对总氮几乎没有去除效果。补加碳源并开启回流后，出水总氮明显降低，平均出水总氮为6.16 mg/L，总氮去除率达到59.00%。乙醇作为一种易被微生物利用的碳源，一方面可直接被反硝化菌利用发挥脱氮作用，另一方面还可被普通异养菌利用消耗DO，有助于营造缺氧厌氧环境，促进反硝化脱氮过程，从而降低出水总氮。

2.2 各级反应池的水质变化

系统在第30 天后稳定运行期间各级反应池中的氨氮、总氮、CODCr和DO 的变化见图3。

图3 系统稳定运行期间各级反应池中的氨氮（a）、总氮（b）、CODCr（c）和DO（d）的变化Fig.3 Variations of ammonia （a），total nitrogen （b），CODCr（c）and dissolved oxygen （d） concentrations in each stage during the stable operation

由图3 可以看出，随着余水处理进程，氨氮逐级降低，尤其在后3 级的好氧环境中快速降低，出水平均氨氮为（1.30±1.13） mg/L。进水中的平均DO 为3.15 mg/L，在补加碳源且开启回流的条件下，沿程DO 逐渐下降，在第2 级时DO 下降至0.42 mg/L，加上碳源的补充，达到了反硝化细菌进行脱氮的缺氧环境，总氮到第3 级时下降到（6.73±2.41） mg/L，之后由于碳源的缺乏以及DO 的存在，总氮保持较为稳定。

2.3 各级反应池中氨氧化微生物的丰度及群落结构

在系统中氨氧化微生物负责将氨氮转化为亚硝酸盐，是硝化过程中的限速步骤〔20〕。各级反应池中氨氧化微生物的丰度变化见图4。

图4 各级反应池中AOB amoA （a）、AOA amoA （b）、CAOB amoA （c）以及16S rRNA （d）的丰度变化Fig.4 Variations of AOB amoA （a），AOA amoA （b），CAOB amoA （c）and 16S rRNA （d）abundances in different stages

由图4 可以看出，3 类氨氧化微生物的amoA基因丰度在各级反应池中的变化趋势一致，均在后3级好氧池中的丰度较高，这与氨氧化微生物好氧化能自养的营养摄取方式相一致。在后3 级好氧池中，AOBamoA的丰度在（3.53～5.54）×107copies/mL，大约是CAOBamoA〔（1.67～2.25）×107copies/mL〕的2～3 倍。自CAOB 发现以来，已发现其在多种水处理工艺中与AOB 同时存在〔21-22〕，甚至在氨氧化过程中占据主要地位，打破了以往氨氧化过程仅由AOB主导的传统观念〔23-24〕。AOAamoA在系统中的丰度较低〔（1.32～2.10）×106copies/mL〕，因此推测系统的氨氧化过程主要由AOB 和CAOB 负责。而对于总细菌来说，在设备第1 级中的丰度最高，主要由于进水和补加的碳源为异养菌提供了丰富的碳源。相比于普通异养菌，硝化细菌生长较为缓慢，极易受到水量和水质波动的冲击，而系统中固定化填料的存在为硝化细菌的生长繁殖提供了有利条件，避免了随水流流失的风险，因而在系统中保持了较高的丰度，保障了在进水波动的条件下系统仍有稳定的硝化性能。

2.4 各级反应池中反硝化基因丰度

菌剂P.stutzeri是在污水处理系统中筛选出的好氧反硝化菌株经扩大培养而成，该菌属具有高效的反硝化能力，且在活性污泥系统强化实验中取得了显著的脱氮提升效果〔25〕，因而在本系统中作为强化菌剂予以投加使用。反硝化基因丰度可在一定程度上代表系统中微生物的脱氮能力，各级反应池中的P.stutzeri及反硝化基因丰度见图5。

图5 各级反应池中P. stutzeri （a）及反硝化基因narG （b）、napA （c）、nirS （d）、cnorB （e）以及nosZ （f）的丰度变化Fig.5 Abundance variations of P. stutzeri （a） and denitrifying genes narG （b），napA （c），nirS （d），cnorB （e） and nosZ （f） in different stages

由图5（a）可知，P.stutzeri在第1 级、第2 级缺氧反应池中具有较高的丰度，而在后3 级的好氧环境中丰度较低，说明该菌在缺氧环境中更容易形成竞争优势，这与研究者对该菌属的研究结论相一致〔26〕。另外，聚氨酯基填料有效避免了P.stutzeri菌剂在系统中的流失，对维持其在系统中的丰度起到了促进作用〔12〕。值得说明的是，由于进水以及回流污水中DO 的带入，前两级缺氧反应池中的DO依然有1.70 mg/L 和0.42 mg/L，因而会对传统反硝化菌的脱氮能力造成显著的抑制作用，而P.stutzeri属于好氧反硝化菌，可在一定的DO 条件下发挥反硝化作用，而且前两级缺氧池中具有较高浓度的碳源，因此在缺氧池中投加菌剂P.stutzeri可有效维持其生长优势并显著提高系统的反硝化能力〔27〕。对各编码反硝化酶的反硝化基因narG、napA、nirS、cnorB、nosZ的丰度进行研究，由图5（b）～图5（f）可知其呈现出了一致的变化趋势，即在前3 级反应池中丰度较高，平均丰度均比后两级高出1～3 个数量级。系统补加碳源后，充足的碳源和氮源为反硝化菌富集营造了良好的生长环境，也与前3 级总氮去除率较高的结果相呼应。而进入好氧区后，较高的DO 快速消耗了碳源，使反硝化菌生长受到抑制，尤其在后两级中，碳源的缺乏使反硝化基因丰度维持在较低的水平。

2.5 各级反应池中微生物群落与功能分析

各级反应池中丰度占比大于2%的细菌群落结构在属水平上的分布见图6。

由图6 可知，各级反应池中的微生物群落结构存在着明显差异，前两级缺氧池中Massilia和Arthrobacter属占有较高的相对丰度。其中Massilia属的丰度在第1 级、第2 级反应池中分别占总细菌的22.97% 和38.70%，Arthrobacter属分别占9.39% 和2.87%。有研究表明2 个菌属具有高效的异养硝化和好氧反硝化能力，在碳源充足的条件下菌株M.neuiana对氨氮和亚硝氮的去除率均可达到90%以上〔28〕，菌株A.arilaitensis在温度低至15 ℃的条件下对硝态氮的去除率依然可达到100%〔29〕。值得注意的是，好氧反硝化菌虽然具有同时利用硝酸盐和氧气作为电子受体的能力，其反硝化效率依然会受到高浓度氧气的抑制，因此，得益于缺氧池中较高浓度的碳源以及较低的DO，两个菌属在前两级缺氧池中保持了较高的丰度。在第3、4、5 级生物反应池中，Flavobacterium是丰度最高的菌属，分别占总细菌数的29.0%、44.1%和56.8%。Flavobacterium属同样具有优秀的异养硝化和好氧反硝化能力，当分别以氨氮和硝氮为唯一氮源时，一株Flavobacterium菌株的脱氮效率可分别达到49.1% 和36.5%〔30〕。因此，丰富的群落结构组成，尤其是具有硝化和反硝化功能菌属的大量存在，保障了系统高效的有机物和总氮去除能力。

PICRUSt 能够很好地搭建从物种到基因功能的桥梁，通过生物信息算法很好地挖掘微生物群落的功能信息〔19〕。图7 展示了各级反应池中细菌反硝化代谢通路的功能预测。

图7 各级反应池中反硝化功能的PICRUSt 预测Fig.7 PICRUSt prediction of denitrification function in different stages

由图7 可以看出，各级生物反应池中均存在丰富的氮氧化物还原酶来催化脱氮过程中的反硝化反应，保证了系统将硝酸盐向氮气的逐步转化。除一氧化氮还原酶外，硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、氧化亚氮还原酶在前3 级中保持了较高的丰度而在后两级中丰度较低，保证了系统缺氧反应池中充分的反硝化功能，这与反硝化基因的定量结果一致。一氧化氮还原酶在后3 级中丰度较高可能是由于包括硝化细菌在内的多数好氧细菌也携带有一氧化氮还原基因，而使用的cnorB引物仅对部分反硝化菌的一氧化氮还原基因进行了扩增，导致功能预测结果与定量PCR 结果出现差异。值得注意的是，氧化亚氮还原酶在前3 级中的丰度显著高于后2 级，保证了反硝化过程产物由氧化亚氮向氮气的转化，缓解了温室气体氧化亚氮的排放〔31〕；但是，好氧池中由于硝化细菌可通过自养反硝化过程产生氧化亚氮，而又没有足够的氧化亚氮还原能力，推测好氧池将是氧化亚氮产生与排放的主要区域。

根据16S rRNA 测序结果进一步对各级反应池中的硝化细菌群落结构进行考察，将从属于AOB、CAOB、AOA 以及NOB 的OTUs 与代表序列制作的系统发育树见图8。

图8 系统中硝化细菌的系统发育树Fig.8 Phylogenetic tree of nitrifying bacteria in the system

由图8 可以看出，AOB 主要由OTU200 和OTU417 组成，属于N.oligotropha分支〔32〕。AOA 仅包含一个OTU，即OTU396，属于Nitrososphaera分支〔33〕。而对于包含有CAOB 以及NOB 的Nitrospira属，只有OTU562 属于Nitrospiralineage Ⅱ，但由于16S rRNA 并不能准确区分CAOB 以及NOB〔34-35〕，只能推测OTU562 可能是CAOB。另外，OTU93，OTU210，OTU273 属于Nitrospiralineage Ⅰ，是只有亚硝酸盐氧化功能的NOB。与许多学者研究一致，Nitrosomonas是污水处理系统中AOB 的主要菌属，而Nitrosospira属的丰度通常较低甚至不存在〔36-37〕，主要归因于具有较高氨氮亲和力的Nitrosospira菌属更适应在低氨氮条件下生存，而低氨氮亲和力的Nitrosomonas菌属在污水处理系统这类富含氨氮的环境中具有生长和表达活性的优势〔38-40〕。将硝化细菌的OTUs 在各级反应器中的丰度以热图形式展示（图9），可以看出，3 类氨氧化微生物的结果与定量PCR结果一致，主要在好氧池中保持了较高的丰度，尤其在第4 级和第5 级反应池中。对于Nitrospira来说，虽然其对氧气的亲和力低于AOB，但第4 级、第5 级反应中较高的DO 保证了其生长并没有受到限制，因而维持了较高的丰度，确保了系统的完全硝化性能〔41-43〕。