荆门某填埋场渗滤液的微生物群落结构及功能分析

赵 倩，陈丽媛，李小堃，漆韫绸，潘红忠，祝贤彬

（长江大学油气地球化学与环境湖北省重点实验室，湖北武汉 430100）

卫生填埋是世界范围内最常见的城市固体废物处理方法，可处理近60%的城市生活垃圾。尽管垃圾填埋场可以有效地消除或最大限度地减少废物对环境的不利影响〔1〕，但在填埋过程中仍会产生大量的气体和深棕色或黑色具有强烈腐臭味的液体，严重污染周围的环境，威胁人类健康。这种高浓度有机废水被称为垃圾渗滤液（Landfill leachate），其氨氮高，污染物成分复杂，是世界公认的污染威胁最大和难于处理的高浓度有机废水〔2-3〕。城市生活垃圾的异质性和分解导致渗滤液中存在丰度多样的微生物群落，具有代谢复杂基质的能力〔4-7〕。然而，渗滤液中微生物群落的多样性和代谢功能仍不清楚。因此，深入探究渗滤液的微生物群落结构及代谢功能，对于调控渗滤液微生物组成和提高垃圾降解效率有重要意义。

目前针对于垃圾渗滤液的微生物群落结构的研究较少。如表1 所示，J. E. MCDONALD 等〔8〕分析研究了英国3 个垃圾渗滤液的群落结构发现Fibrobacters 为其主要的细菌门类；B. W. STAMPS 等〔9〕通过分析美国6 个地区19 个垃圾渗滤液的群落结构发现无论地理位置如何，Firmicutes 和Proteobacteria 为主要的微生物群落；T. KÖCHLING 等〔10〕研究了巴西3个不同年龄垃圾填埋场的渗滤液微生物群落结构，发现Firmicutes 为优势菌门，并且其丰度随着填埋时间的增加而增加，其他丰度较高的门包括Bacteroidota、Proteobacteria 和Spirochaetes；Han KE 等〔11〕研究了中国东南沿海两个大型城市生活垃圾填埋场的细菌群落结构，发现Thermotogota、Firmicutes 和Bacteroidota 是3 个优势门，并且也检测到许多与大分子降解相关的细菌属，例如Defluvititoga、Hydrogenispora和Lentimicrobium。

然而，目前却有大量研究报道了不同处理工艺下，如SBR（序批间歇式活性污泥法）、耦合短程硝化反硝化等，垃圾渗滤液处理前后微生物群落结构的变化，此类研究的目的主要是为了分析出降解垃圾渗滤液中污染物的土著微生物类群。徐芯渝等〔12〕研究菌株Rhodopseudomonas palustris对强化处理渗滤液的效果，结果表明，添加了该菌株的SBR反应器脱氮除磷效果明显增强且主要优势菌门为Proteobacteria 和Chloroflexi；赵晴等〔13〕研究了短程硝化反硝化耦合厌氧氨氧化工艺中微生物的群落结构演替，发现该工艺门水平上优势菌群为Planctomycetes，丰度为54.94%，属水平上主要菌属为Candidatus Kuenenia，丰度为49.66%；吴长淋〔14〕通过对比两种渗滤液处理系统（纯好氧和厌氧好氧）中微生物群落结构多样性，发现了厌氧反应器中菌群主要包括Bacteroidetes、Firmicutes 和Synergistetes，好氧反应器主要菌群为Proteobacteria 和Bacteroidetes。这些研究能为渗滤液中微生物种群的多样性和功能提供重要的参考依据。然而，根据现有资料，渗滤液中微生物的多样性和代谢功能特征还远未得到全面描述〔15〕。高通量测序技术作为一种生物学领域新技术，具有效率高和测序量大的优势，是分析垃圾渗滤液的微生物组成、识别功能性微生物菌群和功能性基因、研究微生物之间相互作用的有力工具，被普遍用于样品微生物群落的研究〔16〕。因此，本研究采用了高通量测序技术来分析渗滤液中细菌和真菌的组成和相对丰度，并确定优势群体，为进一步了解渗滤液中微生物群落结构和多样性等提供科学依据〔17〕。

1 材料与方法

1.1 垃圾渗滤液采集与保存

本研究中采用的渗滤液是填埋龄在3 a 左右的垃圾渗滤液，试验用垃圾渗滤液取自湖北省荆门市沙洋县某设计日处理规模为170 t 的城市生活垃圾填埋场（地理位置为北纬3°71′，东经112°50′），填埋作业区周边设置有截洪沟、排雨水沟。当地处于亚热带季风气候，一年四季分明。年平均降雨量为793.27 mm，年平均气温17.1 ℃。采集到的渗滤液样品立即与等体积的无水乙醇混合并储存在已消毒的1 L 容器中，在24 h 内送回实验室。在实验室中，渗滤液样品在分析前于4 ℃条件下储存〔18〕，渗滤液样品理化指标见表2。

表2 渗滤液理化指标Table 2 Physicochemical parameters of leachate samples

1.2 理化指标测定

渗滤液样品pH、水温（WT）采用水质分析仪现场测定，实验室进行氨氮（NH3-N）（纳氏试剂分光光度法，HJ 535—2009）、硝态氮（NO3--N）（紫外分光光度法，HJ/T346—2007）、总氮（TN）（碱性过硫酸钾消解法，GB 11894—1989）、总磷（TP）（钼酸铵消解法，GB 11893—1989）、COD（重铬酸钾滴定法，GB 11914—1989）等指标的测定，测定均重复3 次。

1.3 垃圾渗滤液DNA 提取

渗滤液样品先用粗棉布过滤以去除碎片和其他颗粒，然后以14 000 r/min 的转速离心10 min，以收集颗粒。随后，用真空装置将滤液通过孔径为0.22µm 的滤膜，将含有微生物的颗粒和滤膜一起用于DNA 提取，使用Fast DNA®SPIN Kit 试剂盒（MP Biomedicals，U. S.）提取样品总DNA；用1.5%琼脂糖凝胶电泳评估DNA；用NanoDrop1000 紫外分光光度计测定DNA 浓度和纯度；提取的DNA 样品在测序前储存在-80 ℃的环境下〔1〕。

1.4 垃圾渗滤液PCR 扩增和高通量测序

采用GeneAmp 9700 PCR 仪（ABI，CA，U. S.）对提取的DNA 样品进行PCR 扩增，选取两对引物扩增细菌和真菌的16S rRNA，引物515F（5’-GTGCCAG CMGCCGCGGTAA-3’）和907R（5’-CCGTCAATTC MTTTRAGTTT-3’）用于扩增细菌16S rRNA 基因的V3～V4 高变区〔9〕，引物ITS1F（5’-CTTGGTCATTTA GAGGAAGTAA-3’）和ITS2R（5’-GCTGCGTTCTTC ATCGATGC-3’）对真菌ITS 区进行PCR 扩增。PCR扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃1 min 30 s，31 个循环；72 ℃ 1 min，10 ℃终止，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并采用Illumina Miseq PE250 平台对扩增子片段进行高通量测序〔19〕。

1.5 序列数据处理与生物信息学分析

根据测序样品的条形码，将原始测序结果准确分配至各测序样品，利用FLASH、QIIME 质量过滤器和UCHIME 等软件获得高质量序列。通过UPARSE聚类和注释与有效序列相似度超过97%的序列，获得可操作分类单元（OTUs），使用Origin 绘制菌群门和属水平上的物种分布图，将样品中无法识别该分类水平的类群统称为未知类群（unclassified），并且门水平相对丰度低于1%和属水平低于2%的类群，统称为其他类群（others）〔13〕。使用FAPROTAX 对渗滤液细菌群落进行生态功能预测，采用Tax4Fun（v 0.3.1）预测细菌群落的代谢功能。所有数据处理采用Excel 2019，并使用Origin 2021 进行绘图。

2 结果与分析

以垃圾渗滤液为研究对象，提取微生物总DNA，采用高通量测序技术，进行测序统计，之后对渗滤液中细菌和真菌的相对丰度进行了分析，并进行了功能预测。

2.1 测序统计

垃圾渗滤液细菌样品共获得47 935 条高质量基因序列，平均长度为360 bp。真菌样品共获得98 571 条高质量基因序列，平均长度为229 bp。常用α多样性分析微生物群落，其中表征菌群丰度（Community richness）的指数为OTUs 和Coverage 指数，用于评估样本中物种组成的丰富度和均匀度，指数越大越好；表征菌群多样性（Community diversity）的指数为Shannon 和Chao-1 指数，二者越大说明样品中物种的复杂程度越高〔20〕。表3 和图1 为垃圾渗滤液的α 多样性结果，细菌群落的OTUs、Chao-1、Shannon 和Coverage 指数分别为622、694.22、4.35 和99.79%，真菌群落的OTUs、Chao-1、Shannon 和Coverage 指数分别为120、119.97、2.97 和99.98%。细菌和真菌的多样性指数都较大，说明渗滤液样品的微生物丰度和多样性较高，Coverage 均大于99%，说明数据准确可靠。

图1 α 多样性Fig.1 Alpha diversity

2.2 微生物群落结构

垃圾渗滤液样品通过高通量测序得到的OTUs分别在门、纲、目、科、属5 个分类水平进行比对鉴定，结果见图2。

图2 渗滤液微生物群落结构Fig.2 Microbial community structure of leachate

细菌样品物种注释统计结果为：23 个门，62 个纲，130 个目，195 个科，315 个属。在细菌门水平上，相对丰度≥1.00%的共9 个门。如图2（a）所示，其中Proteobacteria 占比最大为50.26%，Bacteroidota 占13.48%，Desulfobacterota 和Campilobacterota 分别占8.63% 和8.47%，其次为Actinobacteriota（5.30%）、Firmicutes（4.71%）、Spirochaetota（2.89%）、Thermotogota（2.68%）和Synergistetes（1.37%），其余门类均低于1.00%，总计占比为2.21%。因此，Proteobacteria 为该垃圾渗滤液中的优势菌门。

如图2（b）所示，在属水平，全部细菌序列至少有315 个属，其中丰度≥2% 的属有10 个（共占52.23%），Pseudomonas所占比例最高，为20.25%，并且Pseudomonas作为一种自然界常见的病菌，更容易在高COD、高TN 和高NH4+-N 的垃圾渗滤液处理体系中生存并富集〔3〕。其余9 个属分别为Sulfurimonas（8.08%）、Desulfuromonas（3.74%）、MSBL7（3.38%）、Thiobacillus（3.33%）、Leucobacter（2.89%）、Sphaerochaeta（2.75%）、Lentimicrobium（2.64%）、Defluviitoga（2.64%）和Lutibacter（2.53%）。不足2%的属有305个，属于Proteobacteria 门有9 个，丰度为11.6%；属于Bacteroidota 门有3 个，丰度为4.64%。

垃圾渗滤液样品中鉴定出的真菌分属于4 个门、12 个纲、21 个目、31 个科和38 个属。在真菌门分类水平上，微生物组成如图2（c）所示，主要的微生物群落为unclassified_k_Fungi（29.93%）、Basidiomycota（26.04%）、Ascomycota（25.89%）和Rozellomycota（18.14%）。

真菌属水平分类上，如图2（d）所示，主要的微生物群落为unclassified_k_Fungi（29.92%）、Apiotrichum（21.62%）、unclassified_p_Rozellomycota（18.03%）、Penicillium（7.81%）、Candida（5.49%）、Talaromyces（4.23%）、unclassified_f_Ophiostomataceae（2.39%）、Aspergillus（2.29%）、unclassified_o_Hypocreales（2.02%）、Trichosporon（1.24%）、others（4.97%）。

2.3 功能预测

通过Tax4Fun 对渗滤液细菌中的微生物进行功能注释，预测序列主要属于代谢（37.27%）、环境信息处理（21.95%）、遗传信息处理（7.11%）和细胞过程（2.07%）。KEGG 途径代谢有最丰富的代谢群，基于KEGG 数据库的功能基因注释见图3。

图3 基于KEGG 数据库的功能基因注释Fig.3 Functional gene annotation based on the KEGG database

如图3 所示，在KEGG 水平2 的代谢水平中，与其他功能相比，渗滤液微生物中氨基酸代谢（12.49%）、碳水化合物代谢（11.69%）、辅因子和维生素的代谢（6.63%）和能量代谢（6.46%）的代谢功能丰度最高，这些基因参与细胞的代谢，是微生物生长的基础，氨基酸在填埋期间可以作为微生物生长和代谢的能量和碳源，碳水化合物可以为降解纤维素和半纤维素提供基质，辅因子和维生素的代谢可以维持代谢稳定，表明与碳相关的代谢和有机物质的生物转化具有高活性〔1〕。与环境信息处理相关的基因也有较高的丰度，如膜传输（11.14%），信号转导（10.81%）。另外还有与遗传信息处理相关的基因，如复制和修复（3.68%），翻译（3.43%），折叠、分类和降解（2.07%）。研究表明渗滤液微生物存在相互作用关系，可以进行能量代谢、物质交流和信息传递〔3〕。

通过FAPROTAX 对渗滤液细菌群落进行功能预测，结果见图4。

图4 细菌群落功能预测Fig.4 Prediction of bacterial community function

如图4 所示，细菌微生物主要以碳（C）、氮（N）和硫（S）元素循环代谢型和动物病原型微生物为主，其中碳循环代谢型相关的微生物主要以化能异养作用、有氧化能异养作用、发酵作用、甲烷生成作用、碳氢化合物降解为主；氮代谢相关微生物主要以硝酸盐还原、硝酸盐呼吸、亚硝酸盐呼吸为主；硫循环相关微生物主要以黑色硫化物氧化、硫化合物呼吸、硫呼吸为主；动物病原型微生物主要是以动物寄生虫或共生体、人类病原体及肺炎人体病原体为主。

2.4 对比分析

Proteobacteria、Bacteroidota 和Firmicutes 是垃圾渗滤液中常见的微生物，在不同地区均被报道为优势菌门〔1〕，与本研究结果一致，说明内陆城市与沿海城市渗滤液的微生物群落结构具有相似性。Proteobacteria 在渗滤液中丰度通常较高，多项研究证明，Proteobacteria 可能参与可溶性基质的发酵，有机污染物的降解，将可溶性糖转化为单糖，减轻污染物的生物毒性〔21〕。Bacteroidota 和Firmicutes 是厌氧环境常见的水解酸化细菌，可以促进填埋场复杂有机质的降解，如纤维素、蛋白质、木质素和脂质等〔22〕。

参考目前已发表垃圾渗滤液有关微生物群落论文〔1〕并结合此项研究所获数据，利用SPSS 软件对渗滤液样品的α多样性进行Pearson 相关性分析，结果见图5。

图5 α 多样性相关性分析Fig.5 Correlation analysis of α diversity

如图5 所示，有效序列与Coverage 呈显著正相关（r=0.64，P＜0.01），说明有效序列越多，样品覆盖率就越高，OTUs 与Shannon、Chao-1 呈显著正相关（r=0.70，P＜0.01；r=0.95，P＜0.01），Shannon 和Chao-1都是样品微生物多样性的指标，因此该3 个指标呈显著正相关，与Coverage 呈显著负相关（r=0.84，P＜0.01），Shannon 与Chao-1 呈显著正相关（r=0.63，P＜0.01），与Coverage 呈显著负相关（r=0.51，P＜0.01），Chao-1 与Coverage 呈显著负相关（r=0.93，P＜0.01）。

通常，填埋场的地理位置和物理化学特性是影响渗滤液微生物群落结构的主要因素〔4，6〕。地理差异产生的影响可能取决于气候条件、废物成分和处置过程等因素。这些因素在一定程度上导致不同城市渗滤液理化指标的差异，并影响微生物群落的分布。参考目前已发表垃圾渗滤液有关微生物群落论文〔1〕并结合此项研究所获数据，利用SPSS 软件对渗滤液样品的理化指标（pH、TN、NH3-N、TP 和COD）和微生物进行Pearson 相关性分析，结果见图6。

图6 渗滤液样品中理化指标与微生物的相关性Fig.6 Correlation coefficents between physicochemical indicators and microbial in leachate

由图6 可以看出，相关性指标揭示了渗滤液理化性质与微生物的关系。理化参数中，填埋时长对微生物群落结构有显著影响，与Synergistetes 负相关（r=0.50，P＜0.01），这一结果与前人的研究一致〔23〕，随着填埋年限的增加，有机材料的降解会导致废物成分的变化，这可能会影响渗滤液的微生物群落〔9〕。TN 和NH3-N 也显著影响了渗滤液微生物群落结构，与Firmicutes 显著负相关（r=0.48，P＜0.01；r=0.60，P＜0.01），TP 与Firmicutes 显著负相关（r=0.59，P＜0.01），说明Firmicutes 可能含有与氮磷转化相关的基因。先前的研究〔24〕还表明，填埋场中的一些填埋环境条件，如含氧量、含水量和温度，会影响渗滤液中的微生物群落。然而，本研究并未关注这些因素，有必要进一步研究这些因素及其与其他因素的相互作用对渗滤液产生过程中微生物群落的影响。

3 总结

本研究利用高通量测序技术，对湖北荆门某垃圾填埋场渗滤液微生物群落结构多样性及其功能预测进行了较为详细地研究，探究其种群结构和功能特征，细菌方面共鉴定出23 个门、62 个纲、130 个目、195 个科和315 个属，优势类群为Proteobacteria 门（50.25%）和Pseudomonas属（20.25%）；真菌方面共鉴定出4 个门、12 个纲、21 个目、31 个科和38 个属，其中Basidiomycota 门（26.04%）和Apiotrichum属（21.62%）为优势菌群。基于FAPROTAX 预测渗滤液细菌微生物的生态功能，表明细菌群落主要以碳（C）、氮（N）和硫（S）元素循环代谢型和动物病原型微生物为主，基于Tax4Fun 软件分析预测，渗滤液中存在丰富的代谢功能，尤其是氨基酸代谢和碳水化合物代谢，丰富的代谢基因调控填埋场木质素和纤维素的降解，对于填埋场的稳定具有重要意义。