硫酸盐还原菌浓度检测和腐蚀活性监测方法研究进展

王彦然，唐永帆，肖 杰

（中国石油西南油气田分公司天然气研究院，四川成都 610213）

硫酸盐还原菌（SRB）是一类广泛存在的兼性厌氧微生物，在代谢过程中，主要以有机碳源或铁作为电子供体，以硫酸盐作为电子受体，最终将硫酸盐还原生成硫化氢，促进金属的化学或者电化学反应〔1-2〕，导致金属腐蚀。油气生产中地层产出液和地面注入的各种采油气工业水中普遍含有SRB，极易诱发微生物腐蚀，对生产安全造成极大的威胁〔3-4〕。特别是近年来随着国内非常规页岩气和致密气开发的快速推进，返排液中更是普遍存在高浓度的SRB，使得这方面的问题尤为突出〔5〕。为有效保障油气安全生产，有必要开展对油气田工业水中SRB 的浓度检测和腐蚀活性监测，以准确把握腐蚀风险。近年来，国内外针对SRB 代谢特性和生物膜作用及演变的研究持续深入，在此基础上形成了多种SRB 浓度检测方法以及SRB 腐蚀活性的监测方法〔6〕，它们各自具有不同的特征，适用条件也存在差异。笔者总结了国内外SRB 浓度检测和SRB 腐蚀活性监测方法，并结合油气田SRB 腐蚀评价和控制的实际需求对SRB 浓度检测和腐蚀活性监测相关技术的发展趋势进行了展望，以期为实际生产应用和未来研究提供借鉴。

1 SRB 浓度检测方法研究进展

SRB 浓度检测首先需保证检测结果的特异性，不受其他细菌的干扰。要达到这一目的，需要以SRB 的代谢特征研究为基础。研究表明，SRB 代谢获取能量的过程需要依靠电子供体提供电子，包括有机碳源、铁，甚至CO2〔7-10〕，SRB 细胞通过胞内电子传递过程将获取的电子传给电子受体〔11〕，对于电子受体SO42-，还原过程分为两步：首先将SO42-还原为SO32-，再将SO32-还原为HS-或S2-。而SRB 独特的代谢行为与细胞内特有的3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸还原酶（APS 还原酶）和亚硫酸盐还原酶的催化还原反应有关〔12〕。

因此，国内外以SRB 特有的营养源、代谢过程、代谢产物、生物酶等为基础，对SRB 浓度检测开展研究，形成了多种方法，每种方法在实际应用中均存在各自的优势或不足。实际使用中应充分把握各种SRB 浓度检测方法的特点和适用条件，结合检测需求选择适宜的方法。

1.1 基于细菌培养的检测方法

培养法是通过人工配制培养液或培养基，为SRB 提供相关的营养物质，创造满足SRB 生长需要的物质条件，再根据培养物质中是否出现SRB 生长代谢引起的现象，判定培养体系是否呈现出阳性反应的检测方法。

目前，根据SRB 对元素的需求，形成多种不同类型的培养基或培养液，并制作成相应的检测试剂供生产使用。美国石油学会推荐的绝迹稀释法具有较高的实用性，该方法将待测水样按比例逐级稀释，根据培养介质是否出现SRB 代谢生成的黑色沉淀判定阴阳性，再根据平行实验中各组阳性反应瓶的个数，应用概率统计理论计算所测水样中的细菌浓度〔13〕。因为该方法应用概率理论弥补了取样随机性的缺陷，所以精度较为可靠，再加上操作简单、不依靠昂贵精密的设备，已得到大力发展并相对成熟。但在实际应用中，培养法的检测时间主要由培养物质的组分决定，通常在7～21 d 以上，导致其检测效率偏低。通过改变培养物质成分和相应的操作方式形成的较为典型的检测方法还有琼脂深层培养法和琼脂管法。琼脂深层培养法是在培养基中加入了亚硫酸钠，达到还原和除氧目的，根据培养基变黑的时间长短来计算SRB 浓度〔14-15〕。琼脂管法是以胰蛋白胨为唯一的营养源，3 d 内根据可数的菌落个数和稀释倍数换算得到结果。与绝迹稀释法比较，这些方法的操作繁琐，而且很可能因反应程度较弱或杂质干扰造成假阴性或假阳性现象，降低检测精度。综上，基于SRB 培养形成的方法普遍存在检测周期较长的缺陷，难以满足快速检测SRB 浓度的生产需求，但以绝迹稀释法为代表的检测方法能够实现只测活细菌浓度和取得可靠结果的目的，且操作简单，所以在日常的科研工作和生产实践中仍被广泛使用。

1.2 基于SRB 代谢物质的检测方法

SRB 代谢能够产生多种代谢产物，有报道提出通过检测三磷酸腺苷（ATP）的浓度表征SRB 浓度，但因ATP 是所有生物细胞的代谢产物，导致测试结果偏大〔16〕，所以该方法不能特异性检测SRB。

只有检测SRB 特有的代谢产物，才能保证特异性检测SRB。因为还原SO42-是SRB 特有的生命活动过程，所以介质中的硫化物只能源于SRB 的代谢，而且硫化物的浓度与SRB 浓度存在直接的关系，基于以上原理，提出了通过检测低价态S 计算SRB 浓度的方法。有学者通过同位素标记S 元素，关注S 元素的反应过程，通过检测低价态S 中的放射强度来反映SRB 浓度，由此建立了放射性物质测定法〔17〕，即利用同位素35S 标记电子受体SO42-中的S 元素，使其在SRB 的生物催化作用下被还原成为FeS的组成元素，再人为地将SRB 代谢产生的FeS 与酸和Zn2+反应生成ZnS，最后利用闪烁计数法检测ZnS中35S 的强度，得到SO42-的还原率和SRB 浓度。该方法对检测条件要求较高，需在无氧条件下进行。

另外，还有其他基于检测SRB 代谢产生S2-的思路建立的检测方法。三碘化亚甲基蓝法也是通过S2-检测SRB 的方法〔18〕，三碘化亚甲基蓝在待测水样中先后与维生素C 和S2-反应，分别生成亚甲基蓝氧化型和亚甲基蓝还原型，如存在S2-，液体会发生先变蓝再变为无色的变化，由此检测SRB 的存在，但该方法难以精确得到SRB 的具体浓度〔19〕。

基于SRB 代谢物质建立的检测方法虽然能够在几小时内得到结果，但因氧气的渗入可能氧化硫化物或S2-，所以这类方法普遍对检测条件的要求较为苛刻，实际操作中难以保证。

1.3 基于遗传基因的检测方法

SRB 能够进行独特代谢作用的根本原因在于自身特有的遗传物质，例如16S rRNA 基因、APS 还原酶基因和异化型亚硫酸盐还原酶基因〔20〕。因此，通过检测SRB 细胞中特有的遗传物质，即能够特异性地检测SRB 的存在及其细胞数量。

DNA 序列是表征遗传信息的载体，选择SRB 特有基因序列进行研究，并形成了系列特异性检测SRB 特有DNA 的检测技术。PCR 技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，所用引物可根据16S rRNA 基因特征序列设计，该技术在SRB检测的应用中，可依据SRB 细胞内存在的异化型亚硫酸盐还原酶基因进行分析鉴定〔21〕。随着对SRB菌种和遗传特性研究的深入，PCR 技术也得到不断发展。有学者以SRB 的功能基因dsrB为检验目标，分别对浅水层、土壤和地下深部热水的SRB 浓度进行检测，建立了SRBddPCR 检测技术〔22〕；也有学者发明了SRB 直接倍比稀释PCR 快速定量检测方法；E.BEN-DOV 等〔23〕基于SRB 的dsrA和apsA基因建立了一种实时PCR 检测技术，PCR 技术对SRB 检测的适应性不断提高。魏利等〔24〕基于APS 还原酶的特异性，还将PCR 技术与绝迹稀释法结合建立了一种快速定量的检测方法，检测效果有所提升，但需配合电泳等操作，且菌液保存条件为-20～4 ℃，为该方法的推广应用增加了难度。进一步分析物种DNA 的差异，形成了能够特异性识别并切割目标DNA 特殊碱基序列的限制性片段长度多态性检测方法（RFLP）〔25〕。该方法用于检测SRB 时，都是基于SRB385 序列片段进行的切割，得到片段再通过分子探针的杂交技术进行检测。它可与PCR 联合使用，基于SRB 中独特的dsrAB基因片段，利用RFLP 对PCR 产物进行切割，提高检测精度。

还有一些基于核酸检测形成的方法，它们主要采用寡核苷酸探针与SRB 特有基因的杂交进行检测。其中一种方法是斑点杂交法，采用放射性标记的寡核苷酸探针与RNA 杂交，冲洗后通过放射性强度确定RNA 的数量，该方法的检测结果易受菌株生长阶段影响，不稳定。另外一种方法是原位杂交技术，它是在不改变细胞形态和微生物小环境条件下进行的杂交，目前常用的是荧光原位杂交技术（FISH），检测时用荧光素标记寡核苷酸探针完成杂交，再用显微镜观察细胞内的荧光标记，确定物种和数量。王明义等〔26〕通过SRB385 寡核苷酸探针与脱硫球菌属的荧光原位杂交实验，建立了淡水湖泊SRB 荧光原位杂交检测方法。张伟等〔27〕也将该技术用于分析喀斯特山地土壤中SRB 的数量和空间分布状况，均取得了理想的检测结果。基于遗传物质形成的检测方法具有检测时间短和特异性强的优势，但因需要高技术水平的操作人员，大面积推广到工业生产中还存在一定的难度。

1.4 基于特异性生物酶的检测方法

除了特有的遗传物质，SRB 还具有一些区别于其他生物的性状特征，例如SRB 细胞特有的免疫特性（主要体现为细胞与抗体的选择性附着）和细胞内特有生物酶（可催化作用系列特征显色反应）。所以，利用这些特有的性状特征，同样能够达到特异性检测SRB 浓度的目的。

基于SRB 细胞表面存在特异的抗体附着点，形成了间接荧光抗体技术（IFA）和表面荧光/细胞表面抗体法（ESCA），前者将已用荧光标记的抗体结合抗原，后者是待抗体与抗原结合后，再对抗体标记，两者都通过检测细胞荧光强度得到SRB 浓度。实验中，采用荧光标记抗体，利用抗体对SRB 细胞的选择性附着鉴别介质中的SRB，最后采用荧光显微镜观察附着抗体的荧光标记，得到SRB 细胞数量。Hongwei LIU 等〔28〕利用荧光显微镜观察土壤中不同含水量条件下SRB 在金属表面的附着情况，得到了SRB 附着量与土壤含水量的关系。

酶联免疫吸附法（ELISA）进一步利用抗体抗原的特异性反应，结合酶的高催化活性，按照免疫识别，信号输出和数据处理的步骤，通过将SRB 菌体中的抗原和特异性抗体结合，再利用SRB 细胞特有生物酶的催化作用来完成检测过程，得到SRB 浓度〔29-30〕，该方法检测灵敏快速，但检测下限为103～104mL-1，适用范围相对有限。

另外，近年来还形成了不依靠抗体，仅利用SRB特有生物酶的高催化活性，催化显色剂的显色反应，再通过反应强度计算SRB 浓度的方法。该方法的实施步骤包括过滤、离心、浓缩、裂解、反应和读数，其中，SRB 细胞在裂解液作用下破裂，释放出APS 还原酶，再将反应试剂加入体系使APS 还原酶催化腺苷-5’-磷酸硫酸盐发生还原反应，生成蓝色还原产物发生显色现象，读取显色介质的OD420，定量检测SRB 浓度。该方法可在1 h 内得到测定结果，具有高灵敏度和强特异性，满足快速检测需求。

上述方法的优势在于灵敏可靠，能够快速得到检测结果，但检测下限普遍偏高且结果会计入死细菌浓度，而且通过荧光标记的方法也必须借助显微镜计数，使得它们在生产中的实用性不强。

1.5 基于生物传感器的检测方法

随着生产中检测要求的不断提高，专门用于SRB 检测的生物传感器得到快速发展，其核心部件主要是生物识别元件与换能器，两者相结合，将生物信号转化为其他便于定量表征的信号进行微生物浓度检测〔31〕。生物识别元件是获取微生物信号的部件，与物理化学传感器整合，来分析响应的生物物质，其性能直接决定了检测的精度，所以在SRB 浓度检测中，需要有能够特异性识别SRB 的生物识别元件。研发过程中，基于对生物酶、抗体、组织等特异性生物信号的检测识别，形成了多种类型的生物识别元件，以满足高检测精度和高灵敏度的要求。同时，识别到的生物信号需要通过换能器转换为定量表征信号，信号与检测物质的浓度成比例，从而实现数据读取。研究形成的换能器可将生物信号转化为多种形式的能量，包括电学、光学、磁学、热学、压电等〔32〕。对于SRB 这类腐蚀微生物的检测，基于电化学生物传感器的检测方法是一类低成本、快速和容易微型化的生物组分分析方法，开发的原理是基于电极表面发生的电化学反应，将被检测介质的化学量转变为电学量的一类传感器〔33〕，分为电流型、电位型和阻抗型3 类，展示了电化学技术在SRB 连续检测方面的应用。

近年来，关于SRB 浓度检测方面的生物传感器研究得到了长足的发展。基于SRB 的代谢特征，相关领域的研究人员通过将新型材料引入传感器，不断提高生物传感器动态检测SRB 浓度的精度和实用性。戚鹏等〔34〕开发了基于纳米信号标记的生物传感器技术，并引入氧化性纳米材料、SRB 生物印记薄膜，借助ZnO/ZnS 转化过程、ZnS 光催化性质等，对生物传感器进行改进。刘宏芳等〔35〕也利用纳米材料提高SRB 生物传感器的微型化检测。万逸等〔36〕在纳米信号标记的基础上，认为氧化锰纳米线和氧化石墨烯的应用具有提供信号标记物和增强信号的功能。贺子君等〔37〕基于Cd2+和Mn2+与SRB 代谢产物S2-的反应，结合连续离子层吸附与反应法，制备得到光电流强度高、对SRB 具有特异性和选择性、检测下限低至28 CFU/mL 的TiO2-NTs/CdS：Mn 光电化学传感器。

关于SRB 传感器的研究还在持续进行，相对于其他方法，生物传感器具有特异性强、灵敏度高、精确度高、响应时间短、稳定性高和可重复性好的优势，为连续检测SRB 浓度提供了条件。但是，在应用条件较为恶劣的油气田生产现场，生物传感器的应用效果还有待进一步验证。

目前，基于各种原理形成的SRB 浓度检测方法的特征分析见表1。

表1 典型的SRB 浓度检测方法比较Table 1 Comparison of typical methods for SRB concentration detection

2 SRB 腐蚀活性监测方法研究进展

SRB 在不同的环境下或不同的生长阶段往往具有不同的代谢活性，其活性强弱水平直接决定了因SRB 代谢引起的腐蚀程度〔38〕。因此仅检测SRB 浓度并不能全面准确地掌握其对设备的腐蚀风险，还必须掌握SRB 的代谢活性。通常，SRB 在高活性状态会快速分泌代谢物形成生物膜，固着于生物膜内部的SRB 具有更高的腐蚀活性，促进局部腐蚀电池的形成，导致菌落附着部位发生严重的电化学腐蚀〔39〕。而且SRB 的腐蚀活性越强，电子转移过程也就越快，从而影响代谢产物体系的性质。

国内外已基于生物膜演变或代谢产物积累过程中的电化学响应特征，初步形成了SRB 腐蚀活性的监测方法，并不断开展室内实验验证，奠定了方法应用的可靠性。

2.1 基于生物膜演变的监测方法

微生物腐蚀是一个电化学过程，涉及到电子的传递，必然引起电化学参数的响应。微生物腐蚀的实验研究中，常用到的电化学数据主要是开路电位、阻抗谱和极化曲线，其中阻抗谱得到的关键参数有双电层电容、电荷转移电阻等，极化曲线得到关键参数有腐蚀电位和腐蚀电流密度。每个电化学参数都具有自身的表征意义，应用中需将各种参数结合分析，以判断材料在SRB 作用下的腐蚀倾向、瞬时腐蚀速率等信息，进一步根据电化学参数在整个SRB腐蚀过程中的变化趋势，分析对应膜内SRB 腐蚀行为的发展趋势。许多学者利用电化学方法研究各种环境下SRB 的腐蚀行为。Qiushi LIU 等〔40-41〕发现SRB 腐蚀体系中的电化学参数变化趋势出现转折点，表明膜内SRB 代谢活性提高，生物膜作用由抑制腐蚀转变为促进腐蚀；柳伟等〔42〕研究得到SRB 腐蚀体系中的开路电位、电荷转移电阻和膜层电阻都出现了明显的下降，同样表明了生物膜导电性增强，电子转移过程加快；舒韵等〔43〕证实了SRB 代谢产物的积累导致生物膜导电性增强，使得电阻参数持续下降，电流参数持续升高。因此利用电化学手段可达到直接监测SRB 腐蚀活性的目的。

据文献报道，在缺乏营养物质的厌氧环境中，SRB 主要是以局部腐蚀的形式对钢铁造成破坏〔9〕，所以近年来对SRB 腐蚀监测技术的研究逐渐集中到对局部腐蚀监测方面。常用的电化学方法在表征局部腐蚀行为方面的效果相对不足，对此，探究形成了系列新技术，不断提高对SRB 腐蚀体系下的局部腐蚀监测水平。电化学噪声技术是基于电化学参数非平衡波动建立的监测技术。相对于极化曲线、开路电位等测试，该技术能够捕捉到试样的局部活性，针对均匀腐蚀和局部腐蚀呈现不同的响应特征，以电位和电流参数的波动反映局部腐蚀倾向及腐蚀速率〔44〕。另外，在电化学测试手段中，丝束电极是一类更能够实现从微观层面上分析试样表面不同点位的电化学参数的手段，华中科技大学基于丝束电极的工作机理形成了阵列电极传感器，该仪器通过零阻电流计和99 根钢丝组成的回路测试试样表面的电流分布，并提供了定量表征局部腐蚀的计算公式〔45〕，标志着局部腐蚀监测技术迈出了实质性的一步。

通过电化学参数响应形成的监测方法理论成熟，能够灵敏可靠地得到监测结果，为SRB 腐蚀行为评价和预测提供指导，在室内实验中得到了较多的应用，但在生产中实现应用还存在诸多困难，监测系统的构建，参数分析模型的形成等都还需要深入研究，而且制作出的传感器对现场复杂环境的适应性还有待进一步验证。

2.2 基于代谢产物积累的监测方法

与基于代谢产物研究SRB 浓度检测方法的原理类似，因还原SO42-是SRB 特有的生命活动，所以通过监测SO42-的还原产物判断SRB 腐蚀活性仍是保证特异性的有效手段。因为S2-在液相中的离子活度便于通过电化学手段实现在线分析和连续监测，所以研究思路主要集中在通过检测液相中的S2-建立监测方法。实现S2-选择性测试的方法主要是硫离子选择电极，它的核心结构包括硫化物选择性膜和固态离子/电子转化层。通过硫化物选择性膜实现对S2-的特异性检测，利用固态离子/电子转化层将离子活度转换为电池电动势〔46〕，所以通过电化学手段测定电动势大小即可计算S2-浓度，进一步分析SRB 的浓度与腐蚀活性。目前，硫离子选择性电极基于全固态离子选择性电极概念不断发展，Xiangyi YE 等〔47〕通过改进电极核心部件建立了全固态硫化物选择性微探针，硫化物选择性膜和固态离子/电子转化层的材质分别为Ag2S 和石墨烯，检测结果经有机荧光探针验证，准确可靠。该方法易于实现在线分析和动态测试，且不产生H2S，但检测条件同样苛刻，无法在开放体系下应用，否则易产生假阴性结果，且无法区分细菌死活。

目前，基于各种原理形成的SRB 腐蚀活性监测方法的特征分析见表2。

表2 典型的SRB 腐蚀活性监测方法比较Table 2 Comparison of typical methods for SRB corrosion activity monitoring

3 展望

为有效保障油气安全生产，需要开展对油气田工业水中SRB 的浓度检测和腐蚀活性监测。目前，关于SRB 浓度检测和腐蚀活性监测已形成多种方法，但上述方法在实际应用中，还存在一定的不足，在今后的研究和应用中，可围绕以下方面开展工作。

3.1 SRB 浓度检测方面

通过检测SRB 特有的代谢产物、遗传物质或生物酶等，能够达到特异性检测SRB 浓度的目的，但检测时间、检测精度和检测下限上难以达到要求。对此，应重点根据各类检测方法的显著不足进行攻关，克服相应短板，重点攻坚如何缩短培养时间、提高检测精度、降低检测下限、减少对精密设备依赖，提高工业生产应用效果的可靠性。另外，生物传感器的发展为现场在线连续检测SRB 浓度提供了条件，不断提高其现场适应性，推广生物传感器的应用将成为SRB 检测技术的一大发展趋势。随着生物传感器的不断成熟，将为油气田提供智能化的检测技术，对于建设智慧化油气田具有积极意义。

3.2 SRB 腐蚀活性监测方面

SRB 腐蚀活性监测方面，理论已比较成熟，但研究成果还难以满足实际应用需求。基于电化学反应或代谢产物特征反应原理，已不断形成更新的监测技术，腐蚀活性监测的灵敏度不断提高，也针对局部腐蚀建立了监测方法。下一步有必要对这些方法的实际应用进行深入攻关，研发能够适应现场复杂环境的监测装置，确保装置在现场气液流动状态下的运行可靠性和监测稳定性，并建立能够高效反馈监测效果及预警腐蚀风险的分析系统，进一步提高腐蚀监测的数字化水平，加快实现生产现场的SRB 腐蚀活性监测，为提高SRB 腐蚀预测水平和在线评价杀菌效果提供先进的技术手段。