植物乳杆菌发酵桑葚酵素工艺优化及质量评价

吴德光 邓学聪 胡智慧 周英彪

(1. 茅台学院酿酒工程系,贵州 遵义 564500;2. 广东石油化工学院生物与食品工程学院,广东 茂名 525000)

桑葚是药食同源植物,含水量极高,采摘后难以长期贮藏和运输[1]。其药用价值尚未得到有效开发,常见的桑葚干、桑葚果酱、桑葚醋、桑葚酒和桑葚茶等都是中低端加工产品[2-3]。如何拓宽桑葚的深加工技术,开发出适合不同人群的桑葚功能食品,提升桑葚果的经济价值将成为桑葚高附加值产业的全新发展方向。桑葚的深加工技术仍主要依赖于微生物发酵,除了生产饮料酒和醋等产品外,桑葚还能生产具有特定生物活性成分的酵素[4-5]。通常酵素产品富含酚类等抗氧化活性物质和维生素等生物活性物质,具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血压、预防慢性病与调节肠胃等功能,从而对机体的健康有一定的帮助[6-7],其中占有率较高的果蔬酵素是以果蔬类植物营养物质为原料,经过植物乳杆菌等乳酸菌发酵而成,可将果蔬中原本人体不能吸收的营养成分转化为人体能吸收的代谢产物,从而使果蔬产品的营养价值大大提高[8]。同时还有研究[9]表明,乳酸菌释放的酶类可促进如花青素等酚类物质的转化,生成绿原酸及咖啡酸等,此类酚类物质能够清除自由基及阻断自由基链式反应而达到抗氧化的效果,并且该类物质也可通过微生物代谢合成。目前未见有以桑葚为原料,植物乳杆菌为发酵菌种,以总酚为指标进行桑葚酵素发酵工艺优化的报道。

研究拟以植物乳杆菌为生产菌种,以新鲜桑葚汁为原料,以总酚为指标,通过单因素试验结合响应面试验优化桑葚酵素的发酵工艺,并对桑葚酵素的质量进行评价,以期为进一步拓宽农产品加工提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑葚:茂名市化州名葚园;

植物乳杆菌:LactobacillusplantarumCICC21790,广东石油化工学院生物与食品工程学院代谢控制发酵研究室保藏;

蛋白胨、酵母粉:生化级,广东环凯微生物科技有限公司;

氯化钠:分析纯,中国医药集团有限公司;

无水碳酸钠、95%无水乙醇:分析纯,天津市大茂化学试剂厂;

福林酚:分析纯,福州飞静生物技术公司;

75%医用酒精:沈阳惠民洗消剂制造公司;

没食子酸:色谱纯,北京索莱宝科技有限公司;

氢氧化钠:分析纯,西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

立式压力蒸汽灭菌器:LS-50HD型,江阴滨江医疗设备有限公司;

榨汁机:WJS1222F型,美的集团股份有限公司;

电子天平:10002型,杭州友恒称重设备有限公司;

双人单面垂直超净工作台:SW-CJ-2FD型,苏净安泰空气技术有限公司;

卧式恒温摇床:DHZ-DA型,苏州培英实验设备有限公司;

数显恒温水浴锅:HH-2型,常州天瑞仪器有限公司;

电热鼓风干燥箱:DHG-9140A型,上海精宏实验设备有限公司;

高速冷冻微量离心机:CF1524R型,上海通善生物科技有限公司;

微机型离心机:PHS-3C型,杭州齐薇仪器有限公司;

紫外可见分光光度计:UV-5100B型,上海元析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚酵素发酵工艺 桑葚酵素发酵工艺主要包括新鲜桑葚榨汁制备、菌种培养、发酵、巴氏灭菌与过滤分装等工序。

(1) 新鲜桑葚汁的制备:从化州名葚园采摘的新鲜桑葚,用纯净水洗干净后,使用经75%医用酒精喷洒消毒的榨汁机将其榨汁,获得桑葚原液,无菌纱布对折4层过滤去除桑葚碎渣,置于2 L的玻璃罐中,贮藏在-20 ℃冰箱保存备用,使用前提前置于4 ℃冰箱解冻24 h。

(2) 菌种培养:从4 ℃冰箱保存的种子液中,按试验所需的10%接种量接到经高压灭菌的LB培养基中,180 r/min,37 ℃进行菌种活化10 h,将活化好的菌种再次按10%接种量接到另一个新鲜LB培养基,同样条件下进行振荡培养,到菌种的对数生长期中后期(大约16 h时)停止培养。

(3) 接种发酵:按试验所需接种量量取菌液,8 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min,弃上清液取菌体,无菌生理盐水洗涤菌体2次得干净的菌体,将经过80 ℃巴氏灭菌的桑葚汁分装每瓶10 mL,按试验所需接入菌种培养发酵。

(4) 发酵液灭菌与过滤分装:将发酵液静置2 h后,吸取上清液在冷冻离心机8 000 r/min,4 ℃离心10 min,取上清液于80 ℃的水浴锅中巴氏灭菌10 min,静置冷却到室温,0.45 μm的滤膜过滤后分装,得桑葚乳酸菌酵素饮料。

1.3.2 单因素优化桑葚酵素发酵工艺试验

(1) 发酵温度对桑葚汁发酵程度的影响:发酵温度共设计6个水平(28,30,32,34,36,38 ℃),新鲜桑葚汁为10 mL,接种量为10 mL/100 mL,发酵时间为24 h,180 r/min摇床进行恒温振荡培养后,取样测定不同温度下发酵液中的总酚含量。

(2) 发酵时间对桑葚汁发酵程度的影响:发酵时间共设计6个水平(12,24,36,48,60,72 h),新鲜桑葚汁为10 mL,接种量为10 mL/100 mL,发酵温度为30 ℃,180 r/min摇床进行恒温振荡培养后,取样测定不同发酵时间下发酵液中的总酚含量。

(3) 接种量对桑葚汁发酵程度的影响:接种量共设计6个水平(5,10,15,20,25,30 mL/100 mL),新鲜桑葚汁为10 mL,发酵时间为24 h,发酵温度为30 ℃,180 r/min摇床进行恒温振荡培养后,取样测定不同接种量下发酵液中的总酚含量。

1.3.3 响应面法优化桑葚酵素发酵工艺试验 根据单因素试验的结果选取总酚含量最高的3个水平,根据Design-Expert 13软件的Box-betoken中心组合设计条件进行试验优化得出最佳的桑葚汁酵素发酵工艺条件。

1.3.4 发酵液总酚含量测定

(1) 没食子酸标准曲线绘制:整个试验避光进行,在7根干净的10 mL的具塞比色管中分别加入配制好的质量浓度为0.1 mg/mL的标准没食子酸溶液为0.00,0.25,0.50,0.75,1.00,1.25,1.50 mL,再加入福林酚试剂1 mL和配制好的质量分数为12%的Na2CO3溶液2 mL,超纯水定容至具塞比色管刻度线并充分振荡摇匀,重复3个平行组,室温下黑暗处避光反应30 min后通过紫外分光光度计测定吸光值[10]。

(2) 发酵液总酚含量测定:整个试验避光进行,经过预试验确定合适的稀释倍数后用超纯水稀释样品,在干净的10 mL的具塞比色管中加入0.25 mL稀释的样品,再加入福林酚试剂1 mL和配制好的质量分数为12%的Na2CO3溶液2 mL,超纯水定容至具塞比色管刻度线并充分振荡摇匀,重复3个平行组,室温下黑暗处避光反应30 min后通过紫外分光光度计测定吸光值,依据没食子酸标准曲线确定样品中的总酚含量[10]。

1.3.5 桑葚酵素质量评价

(1) 感官评定:将制备的桑葚酵素分装10瓶于灭菌锥形瓶中,每瓶20 mL,作为感官评定样品。参与感官评定的人员由10名心情平静且味觉正常的生物工程专业学生组成,从色泽、香味、滋味、体态4个项目对桑葚酵素进行评定。

(2) 可溶性固形物测定:按GB/T 12143—2008执行。

(3) pH值:使用PHS-3C型酸度计测定。

(4) 微生物指标:按GB 4789.3—2016、GB 4789.15—2016执行。

1.3.6 数据处理 没食子酸标准曲线的数据用Excel软件进行绘制,单因素试验数据用统计软件SPSS 22.0进行处理与分析,响应面试验数据用Design-Expert 13软件进行处理与分析。

2 结果与分析

2.1 总酚测定的标准曲线

按福林酚法要求的条件测量吸光值并制作没食子酸标准曲线如图1所示。经过计算得到没食子酸标准曲线的回归方程为y=9.510 4x-0.378 7,R2=0.998,表明线性拟合好。

图1 没食子酸标准曲线

2.2 单因素试验

2.2.1 发酵时间对桑葚酵素总酚的影响 如图2所示,发酵12 h时桑葚酵素的总酚含量较低,随着发酵时间的增加总酚含量逐渐上升,发酵36 h时桑葚酵素的总酚含量达到最大值(42.43 μg/mL),当发酵时间超过36 h后总酚含量逐渐下降。因此,选取24,36,48 h 3个时间作为响应面试验发酵时间的3个水平。

图2 发酵时间对桑葚酵素总酚含量的影响

2.2.2 发酵温度对桑葚酵素总酚的影响 如图3所示,发酵温度为28 ℃时桑葚酵素的总酚含量较低,随着发酵温度的上升总酚含量逐渐增加,发酵温度为30 ℃时桑葚酵素的总酚含量达到最大值(40.25 μg/mL),当发酵温度超过30 ℃后总酚含量逐渐下降。因此,选取30,32,34 ℃ 3个温度作为响应面试验发酵温度的3个水平。

图3 发酵温度对桑葚酵素总酚含量的影响

2.2.3 接种量对桑葚酵素总酚的影响 如图4所示,接种量为5 mL/100 mL时桑葚酵素的总酚含量较低,随着总接种量的增加,总酚含量呈增加趋势,接种量为30 mL/100 mL时桑葚酵素的总酚含量达到最大值(39.68 μg/mL),表明植物乳杆菌的代谢有助于总酚的积累。

图4 接种量对桑葚酵素总酚含量的影响

2.3 响应面试验

根据单因素试验结果,响应面试验因素水平编码见表1,试验设计及结果见表2,方差分析见表3。

表1 响应面试验因素水平编码表

表2 桑葚酵素响应面试验设计及结果

表3 总酚含量回归模型方差分析及显著性检验†

以桑葚酵素总酚含量为指标,得到总酚含量(Y)对发酵时间(A)、发酵温度(B)、总接种量(C)的二次多项回归方程:

Y=-803.151 000+5.573 790A+47.176 120B-0.646 175C-0.094 062AB+0.009 313AC+0.044 000BC-0.036 132A2-0.707 625B2-0.022 555C2。

(1)

图5～图7表明,发酵温度与发酵时间的交互作用对桑葚酵素总酚含量的影响最大,发酵时间与接种量的交互作用对桑葚酵素总酚含量的影响次之,发酵温度与接种量的交互作用对桑葚酵素总酚含量的影响不显著。

图5 发酵温度与发酵时间对桑葚酵素总酚含量的交互影响

图6 发酵时间与接种量对桑葚酵素总酚含量的交互影响

图7 发酵温度与接种量对桑葚酵素总酚含量的交互影响

对回归方程求解后,得出最优的发酵工艺条件为:发酵时间39.30 h、发酵温度31.48 ℃、接种量24.51%,得到的桑葚酵素理想总酚含量为41.11 μg/mL。综合考量仪器条件和可操作性,将发酵工艺条件修正为发酵时间40 h、发酵温度32 ℃、接种量25%。按此发酵条件进行3次平行实验,得到桑葚酵素的总酚含量为(43.48±0.67) μg/mL,与响应面模型的预测值相近,表明优化得到发酵工艺条件具有实际应用价值。

2.4 桑葚酵素的质量评价

2.4.1 感官品质 采用优化的发酵工艺条件酿制的桑葚酵素呈紫红、色泽均匀;具有浓郁的桑葚果香和发酵的香味,无异味;酸味柔和,风味好;无杂质,有光泽,无沉淀。

2.4.2 理化指标 新鲜桑葚汁与桑葚酵素的总酚含量、可溶性固体物和pH值见表4。

表4 桑葚酵素的理化指标

由表4可知,对比之下,优化发酵工艺条件下制得的桑葚酵素总酚含量是新鲜桑葚汁的1.62倍,有助于提高其抗氧化能力。韩晓云等[11]研究也发现桑葚发酵后的酚类物质对DPPH自由基清除率由发酵前的(45.97±2.23)%显著提高到(59.01±3.59)%(P<0.05);对羟自由基清除率由发酵前的(68.68±1.23)%显著提高到(78.55±0.57)%(P<0.05)。发酵后的桑葚酵素pH值相比于未经发酵的新鲜桑葚汁有所下降,表明乳酸菌发酵时发生代谢作用产出乳酸致使发酵液的pH值下降;桑葚酵素的可溶性固体物为5.36%,符合GB/T 31121—2014《果蔬汁类及其饮料》中:发酵果蔬汁的可溶性固体物大于5.0%的标准。

2.4.3 微生物指标 桑葚酵素的微生物指标见表5。

表5 桑葚酵素的微生物指标

由表5可知,该桑葚酵素的微生物指标符合GB/T 31121—2014《果蔬汁类及其饮料》和GB 7101—2022《食品安全国家标准 饮料》的相关标准。

3 结论

以新鲜桑葚汁为原料,植物乳杆菌为生产菌种,总酚含量为指标,经单因素试验与响应面试验优化桑葚酵素发酵工艺,确定最佳发酵工艺条件为发酵时间40 h、发酵温度32 ℃、接种量25%,此发酵工艺下制得的桑葚酵素的总酚含量达(43.48±0.67) μg/mL,是未经发酵的桑葚汁的1.62倍。质量评价结果表明,所酿制的桑葚酵素呈紫红、色泽均匀;具有浓郁的桑葚果香和发酵的香味,无异味;酸味柔和,风味好;无杂质,有光泽,无沉淀。该桑葚酵素指标符合GB/T 10789—2015《饮料通则》、GB/T 31121—2014《果蔬汁类及其饮料》和GB 7101—2022《食品安全国家标准 饮料》的相关标准。后续将对酚类物质组成和含量以及对桑葚酵素品质的影响进一步探究。