生防放线菌ZZ-9颗粒剂的研制及对黄瓜立枯病的防治效果

张 扬，魏岚菁，陈军宏，黑雅娅，薛应钰

（甘肃农业大学植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，兰州 730070）

黄瓜Cucumissativus又名胡瓜、青瓜，属葫芦科一年生草本植物，作为我国的主要蔬菜作物之一，我国生产规模位居世界第一。近年来，随着栽培面积和产量需求逐年增加，土传病害问题随之而来[1,2]，其中影响较为严重的是由立枯丝核菌Rhizoctoniasolani引起的黄瓜立枯病，严重影响黄瓜幼苗的生长甚至造成植株迅速死亡[3]。被害黄瓜茎基部病斑扩大后，产生暗褐色椭圆形病斑，根颈部萎缩干枯，根部缢缩，最后幼苗逐渐枯死，但不呈猝倒伏。地下根部出现椭圆形褐色凹陷斑，死而不倒，根茎皮呈褐色，并逐渐腐烂[4]。目前生产上对该病害的防治主要采用化学防治措施，虽然效果显著，但是长期施用容易造成环境污染，病原菌也容易产生抗药性[5]。而生物防治因具有安全、高效、环保等优点，被人们所重视和青睐[6]，生物防治是未来农业生产中防治病虫害的主要方法，也是未来推广绿色农业的安全保障[7]。目前针对黄瓜立枯病的生防真菌以木霉菌Trichodermaspp.为主[8,9]。生防细菌有枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis、荧光假单胞菌Pseudomonasfluorescens和解淀粉芽胞杆菌Bacillusamyloliquefaciens等[10-12]。但是，有关放线菌防治黄瓜立枯病方面的研究报道较少。链霉菌作为革兰氏阳性放线菌，能够有效的防治植物病害和土传病害，与化学药剂相比具有高效低毒等特点[13,14]。近年来国内外报道一些放线菌能够有效防治立枯丝核菌引起的植物病害，如番茄立枯病、辣椒立枯病、玉米纹枯病、水稻纹枯病等[15-17]。颗粒剂是由原药、载体和辅助剂加工而成的固体颗粒状剂型农药，具有土壤撒施操作方便、持效期长以及安全性高等特点，更适用于土传病害的防治[18,19]。

娄彻氏链霉菌S.rocheiZZ-9 是甘肃农业大学植物病害生物防治实验室分离保存的一株具有自主知识产权的生防菌株（菌种保存号：CGMCC No.15245）。通过前期试验证明，放线菌ZZ-9 菌株对立枯丝核菌R.solani、辣椒叶斑病菌Phaeoramulariacapsicicol、荷兰豆枯萎病菌Fusariumoxysporum和番茄灰霉病菌Botrytiscinerea等有良好的抑制作用，其中对立枯丝核菌R.solani抑制效果最好。因此，本研究以生防菌株娄彻氏链霉菌ZZ-9 菌株为研究对象，以立枯丝核菌为指示菌，筛选不同助剂和载体的最佳配比，确定最佳助剂浓度，对ZZ-9 颗粒剂进行质量标准检测，最后利用室内盆栽试验测定该菌剂对黄瓜立枯病防治效果和促生作用，以其为黄瓜立枯病的防治提供参考，同时为将其商品化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试生防菌株：娄彻氏链霉菌S.rocheiZZ-9；供试病原菌：立枯丝核菌R.solani，以上菌株均由甘肃农业大学植物病害生物防治实验室提供。

载体：凹凸棒土、膨润土、高岭土、硅藻土。

稳定剂：碳酸钙、磷酸钾、羧甲基纤维素钠。

崩解剂：三氯化铝、氯化镁、尿素、氯化钠。

粘结剂：淀粉、聚乙二醇、聚乙烯醇PVA、聚乙烯基吡咯烷酮PVP。

湿润剂：十二烷基硫酸钠、木质素磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠。

小米浸汁培养基：小米10.0 g、葡萄糖10.0 g、CaCO32.0 g、NaCl 2.5 g、蛋白胨3.0 g、蒸馏水1000 mL。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉15 g，蒸馏水1000 mL

高氏一号培养基：可溶性淀粉20.0 g、KNO31.0 g、K2HPO40.5 g、NaCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO40.01 g、琼脂粉15 g、蒸馏水1000 mL。

黄瓜品种：津优35 号（天津科润农业科技股份有限公司）；育苗栽培营养基质土（甘肃绿能农业科技股份有限公司出品）；50%多菌灵可湿性粉剂（山东省泗水丰田农药有限公司）。

1.2 放线菌ZZ-9 发酵液制备

将ZZ-9 菌株在高氏一号培养基上28 ℃活化培养5 d 后，打取3 个5 mm 的菌饼接入装有80 mL 的高氏一号液体培养基的150 mL 三角瓶中，180 r/min、28 ℃振荡培养3 d 制成种子液，将种子液按6%接入小米浸汁培养基于180 r/min、28 ℃振荡培养5 d 即为发酵液。

1.3 放线菌ZZ-9 生防颗粒剂载体筛选

不同种类的供试载体按照一定比例（表1）加入6 mL 发酵液后，观察制剂颜色及是否成型，将不同种类的制剂各取1 g 加入6 mL 无菌水，在180 r/min 的摇床振荡30 min，取1 mL 加入到9 mL 无菌水中，采用10 倍梯度稀释法，均匀涂布于高氏一号培养基上，对照为不加载体的活菌发酵液。每个处理重复3 次，28 ℃黑暗培养5 d 后统计ZZ-9 活菌数。

表1 ZZ-9 生防制剂供试载体Table 1 ZZ-9 biocontrol agent test carrier

1.4 放线菌ZZ-9 生防颗粒剂助剂的筛选

将1.1 中不同种类的稳定剂、崩解剂、粘结剂、湿润剂按照0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的浓度设置加入到6 mL 发酵液，充分震荡均匀。将含有助剂的发酵液与PDA 混合均匀（两者比列为1：9）制成含药培养基，测定对立枯丝核菌的抑菌效果，以添加不含任何助剂发酵液的PDA 为对照。28 ℃黑暗培养5d 后计算抑制率。抑制率（%）=（对照病原菌直径-处理病原菌直径）/（对照病原菌直径-5）×100。

1.5 放线菌ZZ-9 颗粒剂的质量测定

将筛选合适的发酵液与载体比例制成混合物，加入筛选后不同质量分数的稳定剂、崩解剂，湿润剂，分散剂，制得ZZ-9 颗粒剂。

1.5.1 活菌数含量测定 取10 g 制剂置于6 mL 的无菌水锥形瓶中，1200 r/min 的摇床振荡30 min，稀释到105倍均匀涂布于高氏一号培养基上，测定ZZ-9 活菌数含量。

1.5.2 粒度测定 按国家标准“GB/T 15445.5-2011 颗粒剂粒度的测定”为本试验参考标准。选取上下限筛目数60～200 目筛范围内的双筛，取10 g（A）的样品放入筛中后拍打3 min，称量通过大号筛的样品（B），B/A 大于90%为合格。

1.5.3 含水率测定 按国家标准“GB/T 1600-2001 颗粒剂水分测定”。用共沸蒸馏法测定，含水率≤5%合格。

1.5.4 崩解性的测定 取0.5 g 试样加入90 mL 硬水，以每次2 s 的速度颠倒混合，样品颗粒在硬水中溶解时间小于180 s 为合格。

1.5.5 pH 的测定 按国家标准“GB/T 1601-1993 颗粒剂pH 值的测定”。pH 值在6.0～7.5 之间为合格。

1.5.6 硬度的测定 将10 g 的颗粒制剂，倒入有3 个玻璃珠的瓷制瓶中，以75 r/min 的速度颠倒混合15 min后过筛，称量通过大号筛的样品质量W（g），计算硬度：硬度（崩坏率%）=W/试样量×100。

1.5.7 放线菌ZZ-9 颗粒剂热、冷贮藏性测定 参照GB/T 19136-2003 与GB/T 19137-2003，颗粒剂在（40±2）℃与（0±2）℃条件下水浴24 h 后，通过稀释涂板法计算抑菌率和活菌数。

1.5.8 放线菌ZZ-9 颗粒剂杂菌数的测定 将制备好的颗粒剂置于常温下，每隔30 d 取样一次，吸取1 mL稀释105的制剂，均匀的涂布于高氏一号固体培养基上，5 d 后统计杂菌数。

1.5.9 放线菌ZZ-9 颗粒剂货架期测定 将制备好的颗粒剂置于常温下，每隔30 d 取样一次，测定其活菌数。

1.6 放线菌ZZ-9 颗粒剂对黄瓜立枯病盆裁防治效果的测定

选取高度相同的黄瓜幼苗，采用撒施法在每盆黄瓜苗根部左右两侧施入1.0、2.0 和3.0 g ZZ-9 颗粒剂和3.0 g 多菌灵可湿性粉剂。以不施任何菌剂为空白对照。每个处理设15 盆，重复3 次。7 d 后用无菌刀割伤黄瓜主根一周的须根，用立枯丝核菌种子液灌根。1 个月后记录黄瓜立枯病的发病情况，计算防治效果。

1.7 放线菌ZZ-9 颗粒剂对黄瓜的促生作用试验

每个花盆（15 cm×15 cm）中栽植3 株黄瓜幼苗，当幼苗长出2～4 片叶时，在黄瓜苗根际左右两侧撒施3 个不同量的菌剂（即1、2 和3 g ZZ-9 颗粒剂/盆）；50%多菌灵处理组（3 g/盆）为药剂对照，未做任何处理为空白对照。每个处理3 次重复，每个重复15 株苗。30 d 后测定株高、根长、鲜重。

2 结果与分析

2.1 放线菌ZZ-9 生防颗粒剂载体的筛选

不同的载体对ZZ-9 活菌数的影响不同（表2），其中高岭土与硅藻土对ZZ-9 活菌数的影响明显高于凹凸棒土，且制剂酥软，难成型，膨润土对ZZ-9 活菌数的影响与对照相比，达到差异显著性水平，但是制剂硬，难成型。而凹凸棒土对ZZ-9 活菌数基本影响不大，高于对照，且当菌液与凹凸棒土的比例是2∶5时，制剂呈制剂呈砖红色固体，易造粒。因此，选用凹凸棒土作为ZZ-9 颗粒剂的载体。

表2 供试载体对放线菌ZZ-9 生长的影响及混合固态观察Table 2 The effect of the test carrier for the growth of the actinomycete ZZ-9 and observation of mixed solid state

2.2 放线菌 ZZ-9 生防颗粒剂助剂的筛选

2.2.1 稳定剂对ZZ-9 抑菌活性的影响 由图1 可知，不同浓度的3 种稳定剂均对ZZ-9 杀病原菌活性有一定影响。其中不同浓度的磷酸钾和羧甲基纤维素钠不同程度的降低了ZZ-9 的抑菌活性。而当碳酸钙浓度为1%时抑菌率达到了83.71%。同对照相比增强了ZZ-9 的抑菌活性。且碳酸钙化学纯度高、惰性强，有较好的热稳定性[20]，因此选1%的碳酸钙为ZZ-9 颗粒剂的稳定剂。

图1 不同浓度及类型稳定剂对ZZ-9 抑菌活性的影响Fig.1 Effect of different concentrations and types of stabilizers on strain ZZ-9 antimicrobial activity

2.2.2 崩解剂对ZZ-9 抑菌活性的影响 通过图2 可得知，不同浓度的4 种崩解剂对ZZ-9 的抑菌活性有一定的影响，其中不同浓度的三氯化铝、尿素与氯化钠对ZZ-9 抑菌活性抑制较为明显且均低于对照。而当加入2%的氯化镁时，ZZ-9 的抑菌率高于对照为81%。因此，选用2%的氯化镁为ZZ-9 颗粒剂的崩解剂。

图2 不同浓度及类型崩解剂对ZZ-9 抑菌活性的影响Fig.2 Effect of different concentrations and types of disintegrants on strain ZZ-9 antimicrobial activity

2.2.3 黏结剂对ZZ-9 抑菌活性的影响 由图3 可知，不同浓度的4 种粘结剂对ZZ-9 的抑菌效果均有一定的影响，其中加入不同浓度淀粉、聚乙二醇和PVP 时，抑菌率均显著低于对照。加入不同浓度的PVA，ZZ-9 的抑菌率呈先增大后减小的趋势，PVA 浓度为1%时ZZ-9 的抑菌率高于对照，为83.00%。说明PVA与ZZ-9 的生物相容性较好。此外，PVA 稳定性好、成本低、具有良好的水溶性能且对药物影响较小。因此，选用1%的PVA 为ZZ-9 颗粒剂的粘结剂。

2.2.4 湿润剂对ZZ-9 抑菌活性的影响 通过图4 可得知，不同浓度的3 种湿润剂均对ZZ-9 抑菌效果有一定影响。随着湿润剂浓度的增加，ZZ-9 的抑菌率不断降低，其中不同浓度的木质素磺酸钠和十二烷基硫酸钠对ZZ-9 抑菌活性影响最为显著均低于对照。但添加0.5%的十二烷基苯磺酸钠时，与对照相比，ZZ-9 抑菌活性增强为82.33%。因此，选用0.5%的十二烷基苯磺酸钠为ZZ-9 颗粒剂的湿润剂。

图4 不同浓度及类型湿润剂对ZZ-9 抑菌活性的影响Fig.4 Effect of different concentrations and types of wetting agents on strain ZZ-9 antimicrobial activity

2.3 放线菌ZZ-9 剂型及其质量标准测定

通过对载体与助剂的筛选，确定了ZZ-9 颗粒剂最佳配方为：菌液与凹凸棒土比例为2:5，碳酸钙1%，氯化镁2%，聚乙烯醇1%，十二烷基苯磺酸钠0.5%。按照此配方研制出了一种砖红色固体状，易造粒，崩解性好，硬度适中的娄彻氏链霉菌ZZ-9 颗粒剂。

放线菌ZZ-9 颗粒剂质量标准测定结果（表3）表明，活菌数为 1.19×108cfu/g，粒度、含水率、崩解性、pH 值、硬度5 项指标均符合农药颗粒剂的国家标准，说明该菌剂合格，可以用于病害的防治。

表3 ZZ-9 颗粒剂质量检测结果Table 3 Quality test results of ZZ-9 granules

2.4 放线菌 ZZ-9 颗粒剂冷、热贮藏性测定

通过对放线菌ZZ-9 颗粒剂进行冷、热贮藏性测定，结果表明（表4），经冷、热处理后，活菌数分别为1.02×108cfu/g、1.11×108cfu/g，接近于对照。其ZZ-9 颗粒剂对立枯丝核菌抑菌率分别为82.14%、83.33 %，与对照相比，分别低1.79%、0.6%。ZZ-9 颗粒剂有较好的冷、热储藏性，可在田间极端天气下保持稳定。

表4 冷、热处理对ZZ-9 颗粒剂活菌数与抑菌活性的影响Table 4 Effect of cold and heat treatment on the colony count and antibacterial activity of ZZ-9 granules

2.5 放线菌ZZ-9 颗粒剂杂菌数的测定

通过不同时间对ZZ-9 颗粒剂杂菌数测定（表5），结果表明，随着时间的增长，ZZ-9 颗粒剂的杂菌数基本保持稳定，均低于0.30×106cfu/g。说明，ZZ-9 颗粒剂可以防止外界杂菌污染。

表5 ZZ-9 颗粒剂杂菌数的测定Table 5 Determination of the number of bacteria in ZZ-9 granules

2.6 放线菌ZZ-9 颗粒剂货架期测定

通过对放线菌ZZ-9 颗粒剂进行货架期测定结果表明，0～120 d 中ZZ-9 颗粒剂活菌数基本保持不变，均高于1×108cfu/g，表明ZZ-9 颗粒剂在一定时间内能保持较好的稳定性（表6）。

表6 ZZ-9 颗粒剂货架期测定Table 6 Determination of shelf life of ZZ-9 granules

2.7 放线菌ZZ-9 颗粒剂对黄瓜立枯病的防治效果

菌剂对黄瓜立枯病的防治效果如表7 所示，1 个月后，对照组的黄瓜发病率最高86.67%，施用量ZZ-9颗粒剂处理的黄瓜大部分仍健康生长；不同的菌剂施用量对黄瓜立枯病都有较好的防治效果，其中ZZ-9颗粒剂施用量为3 g/盆时发病率在20.00%，防治效果最佳达到76.92%。

表7 不同量的ZZ-9 颗粒剂对黄瓜立枯病的防治效果Table 7 The effect of different amounts of ZZ-9 granules on cucumber Rhizoctonia rot

2.8 放线菌ZZ-9 颗粒剂对黄瓜苗期的促生作用

由表8 可知放线菌ZZ-9 颗粒剂对黄瓜具有明显的促生作用，放线菌ZZ-9 颗粒剂在3 种不同处理下，种子发芽率，株高，根长以及鲜重均高于空白对照组，放线菌ZZ-9 颗粒剂施用量为3 g/盆时，种子发芽率从82.64%提高到90.36%，发芽率、株高、根长和鲜重分别较对照提高了9.34%、29.52%、27.54%、22.96%，促生作用与化学药剂的多菌灵制剂相当。

表8 ZZ-9 颗粒剂对黄瓜的形态学指标的影响Table 8 Effect of ZZ-9 granules on morphological indicators of cucumbers

3 讨论

我国现有的农用微生物杀菌剂剂型种类较为单一，主要为可湿性粉剂，对颗粒剂的研究开发较弱[21]。而颗粒剂具有持效期长、用量少、使用方便、易贮存和使用时无粉尘飘移等优点。且颗粒剂组分中的载体、助剂能够直接或间接地影响菌体活性[22]。因此寻找性能优良，价格低廉，来源广泛并使制剂有良好的生物相容性的载体材料是颗粒剂发展的重要方向[23]。本研究对不同的载体、助剂进行初步筛选和配方优化，发现生防菌ZZ-9 颗粒剂最佳配方为：碳酸钙（稳定剂）1%，氯化镁（崩解剂）2%，聚乙烯醇（PVA，粘结剂）1%，十二烷基苯磺酸钠（湿润剂）0.5%，菌液与凹凸棒土（载体）比例为2:5。郑婷婷等[24]研究发现，生防菌Ht-q6 乳悬剂的最佳润湿剂为十二烷基硫酸钠，稳定剂为KH2PO4，这与本试验结果类似。耿琦等[25]研究发现，淡紫灰链霉菌S3-5 的生防制剂，最佳稳定剂为2.5%甲基纤维素，李鸿坤等[26]研究发现放线菌菌株HJG-5 生防剂型最佳载体为高领土。这与本试验所用的碳酸钙、凹凸棒土结果存在差异，可能是因为不同菌株间的差异性，同种助剂对不同菌株具有不同影响。微生物菌剂的贮存稳定性直接影响产品质量与应用效果,选择合适的载体和添加保护剂能够有效提高微生物菌剂的贮存稳定性[27]。对贮存稳定性研究发现ZZ-9 颗粒剂有较好的冷、热储藏性，0～120 d 的贮藏期间杂菌数基本保持稳定并且活菌数基本保持不变。本研究对ZZ-9 颗粒剂主要性能检测有效活菌数为1.19×108cfu/g，粒度为93.5%，水分含量2.5%，水中崩解时间96 s，pH 值6.35，硬度为10%。这些指标在进行工业化生产中至关重要[28]。

放线菌作为一种重要的微生物资源能够产生丰富的代谢产物抑制病原菌，诱导植物产生抗性，增强植物的抗病性，在植物病害生物防治中有良好应用前景[29]。关于娄彻氏链霉菌防治植物病害相关研究表明，利用娄彻氏链霉菌A-1 处理苹果果实同对照相比能够有效的降低苹果轮纹病病斑面积和发病率[30]。娄彻氏链霉菌ACTA1551 能够保护番茄种子免受尖孢镰刀菌的侵染，促进番茄植株的生长[31]。娄彻氏链霉菌发酵滤液对水稻稻瘟病和茄子青枯病具有良好的防治效果，并且对茄子幼苗具有明显的促生作用[32,33]。该菌株ZZ-9 研究鉴定为娄彻氏链霉菌，其次生代谢产物有较强的稳定性和广谱的抑菌活性，发酵滤液对小麦幼苗具有促生作用[34-36]。牛鑫斌等[37]研究报道利用长枝木霉T6 水分散粒剂防治黄瓜立枯病,其防治效果达到54.8%，与化学农药多菌灵相比，相对防治效果提高了14.8%。黄大野等[38]研究报道利用枯草芽胞杆菌水分散粒剂防治黄瓜立枯病，其防效为71.48%，发芽率、株高、根长和鲜重分别较对照有明显提高。本研究在室内盆栽防效试验中发现菌株ZZ-9 颗粒剂不同的施用量对黄瓜立枯病都有较好的防治效果且对黄瓜具有明显的促生作用。其中施用量3 g/盆时防治效果最佳达到76.92%，而施用量为3 g/盆多菌灵制剂防治效果达到92.31%，显著低于药剂对照。发芽率、株高、根长和鲜重分别较对照提高了9.34%、29.52%、27.54%、22.96%，促生作用与化学药剂的多菌灵制剂相当。可见娄彻氏链霉菌ZZ-9 颗粒剂成为微生物农药具有巨大的潜力，但大田防治试验是否具有高效的防治效果和促生作用还需要更进一步的研究。