杂交竹基腐病生防真菌及其水分散粒剂研制与防效

顾小敏，余嘉雯，朱天辉，陈有忠，刘 韩，李姝江*

（1.长江上游森林资源保育与生态安全国家林业和草原局重点实验室/四川农业大学林学院，成都 611130；2.四川省甘孜州林业科学研究所，康定 626001；3.四川国光农化股份有限公司，成都 610100）

撑×绿杂交竹Bambusapervariabilis×Dendrocalamopsisgrandis是以撑篙竹Bambusapervariabilis为母本，大绿竹Bambusagrandis为父本杂交而成的一个新型竹种[1]，主要分布于华南和西南地区[2]。该竹种具有易繁殖，适应性广及抗性强等优点，可以在维护生态平衡、防止水土流失、涵养水源等方面发挥重要作用[1,3]；其秆劲直，尖削度小，壁厚，纤维含量高，为上等用材竹，具有显著的经济价值[4]。基腐病是一种可由立枯丝核菌Rhizoctoniasolani[5]、腹状镰刀菌Fusariumvenfricosum[6]和层出镰刀菌F.prolifertum等多种病原菌引起的一种病害。F.prolifertum所引起的撑×绿杂交竹基腐病最初从秆基部第一节侵入，呈黑色至黄褐色条状或块状病斑，并在水平和垂直方向上迅速发展，严重者可导致整株枯萎[7]。

木霉Trichodermaspp.是世界性分布的一种生存能力极强的益生丝状真菌，在土壤、植物、植物残体和根际普遍存在。研究证明，木霉对18 个属的29 种植物病原菌具有拮抗作用[8]。其具有抗逆性强、生长速度快、孢子存活期长、对病原菌具有较强的重寄生作用、对环境影响小、以及不易使病原菌产生抗性等特点，可促进植物生长且控制病害发生。木霉的生防机理主要包括竞争作用、重寄生作用[9]、诱导植物抗性等。这些研究都表明了木霉是一种具有较高生防潜力的真菌。前人已成功研发出多种类别的木霉制剂，其中包含木霉分生孢子的腐殖酸吸附制剂、硅藻酸钠制剂[10]。木霉制剂也已应用到植物病害防治中，如拟康宁木霉T.koningiopsis治疗番茄枯萎病[11]、棘孢木霉T.asperellum治疗柑橘黑点病[12]等。不同木霉种类对植物病害防治效果影响显著，就目前研究来看哈茨木霉T.harzianum、棘孢木霉和绿色木霉T.viride研究个例较多且防治效果也较高[13,14]。迄今，世界上已有木霉的商品化制剂有250 余种，如美国的Topshieild（哈茨木霉T-22 菌株）、深绿木霉T.atroviride、拟康宁木霉[15]。研究表明，螺旋木霉可拮抗病原菌数量超过13 种以上，其中对小麦纹枯菌、玉米小斑菌、草莓根腐菌、板栗栗疫病等病原菌均具有较好的拮抗效果[16]；可抑制尖孢镰刀菌F.oxysporum，对土传枯萎病也具有一定生防潜力[17]；同时螺旋木霉对大豆南方茎溃疡病菌和大豆拟茎点种腐病菌也表现出良好的抑菌效果和拮抗作用[18]；螺旋木霉的代谢产物对3 种肿瘤细胞具有显著的抑制作用[19]。虽然螺旋木霉对上述病原菌均具有抑制作用，但研究仅停留在理论水平，将其做成生防制剂并用于病害防治的还未曾报道。本研究以在健康杂交竹根际土中筛选到的螺旋木霉作为对象，通过对该菌基础培养基筛选、发酵条件优化、载体与助剂筛选，确定了最佳配方的水分散粒剂，为杂交竹基腐病的生物防治提供了可靠保障，同时也弥补了螺旋木霉用于生防制剂实例的空白。

1 材料与方法

1.1 材料

供试培养基：PDA（马铃薯葡萄琼脂培养基）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g、蒸馏水1000 mL；PSA（马铃薯蔗糖琼脂培养基）：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂15～20 g、蒸馏水1000 mL；PMA（马铃薯麦芽糖琼脂培养基）：马铃薯200 g、麦芽糖20 g、琼脂15～20 g、蒸馏水1000 mL；Czpeak培养基：硫酸氢二钾1 g、七水硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、琼脂15～20 g、蒸馏水1000 mL；Richard 培养基：硝酸钾10 g、磷酸二氢钾5 g、七水硫酸镁2.5 g、氯化铁0.02 g、蔗糖50 g、琼脂15-20 g、蒸馏水1000 mL；孟加拉红培养基：蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5 g、琼脂15～20 g、1/3000 孟加拉红溶液100 mL、蒸馏水1000 mL、氯霉素0.1 g；燕麦片琼脂培养基：燕麦片30 g、琼胶15～20 g、蒸馏水1000 mL；胡萝卜培琼脂培养：胡萝卜20 g、蛋白胨2 g、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾0.46 g、硫酸镁0.5 g、磷酸氢二钾1 g、琼脂15 g、水1000 mL；番茄琼脂培养基：番茄浸粉5 g，酵母浸粉5 g，乳糖20 g，葡萄糖2 g，磷酸氢二钾2 g，吐温-80 1 g，乙酸钠5 g，琼脂15 g。

供试病原菌：层出镰刀菌，2020 年6 月从四川省仁寿县撑×绿杂交竹基腐病的病竹中分离所得[7]；病原菌孢子液制备：将层出镰刀菌菌饼（6 mm）接种至PDB 液体培养基中（5 块/100 mL），置于28 ℃下160 r/min 培养8 d，用2 层纱布过滤去除菌丝，用血球计数板调节孢子浓度至1×106cfu/mL，4℃下储存待用。

供试植物：两年生、高度为50～70 cm，直径3～5 cm 的撑×绿杂交竹405 株，2022 年8 月购置于四川内江，种植于四川农业大学成都校区温室大棚内，温度在25 ℃～28 ℃，相对湿度70%～80%，光照8～12 h。

试剂与仪器：真菌基因组DNA 提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）、血球计数板（上海市求精生化试剂仪器有限公司）、人工智能气候箱GZ-380-GSL(韶光广智科技设备公司)、振荡培养箱SPX-100B-D（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、沃隆颗粒机WL-150（朕阅五金）、凝胶电泳图像分析系统VnIversalHooD+2（Bio-RAD 公司，美国）、水平电泳槽DYCP-31DN（華信科学实验仪器商城）、基因扩增仪A600（杭州朗基科学仪器有限公司）、五硝·多菌灵（江西中讯农化有限公司）、甲霜·噁霉灵（河北中保绿农作物科技有限公司）、寡雄腐霉菌（捷克生物制剂股份有限公司）、10 种载体、4 种紫外保护剂、4 种润湿剂、4 种稳定剂、4 种黏结剂、4 种崩解剂。载体与助剂详细信息见表1。

表1 供试载体及助剂信息表Table 1 Test vector and auxiliary information table

1.2 生防真菌的分离、筛选与鉴定

生防真菌分离：2021 年6 月从四川省仁寿县撑×绿杂交竹基腐病发生区附近500 m 的健康植株上利用五点取样法采集根际土每点5 g[20]，混合均匀，利用平板稀释法，称取10 g 土样加入盛有90 mL 无菌水的三角瓶中，在25 ℃的恒温摇床上振荡20 min，使土样与无菌水充分混匀，得到浓度为10-1的土壤悬浮液。使用移液枪吸取1 mL 的土壤悬浮液，加入盛有9 mL 无菌水的试管中，充分摇匀，得到浓度为10-2的土壤稀释液。以此类推，获得浓度依次为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的土壤稀释液。取不同浓度的稀释液0.1 mL均匀的涂布在PDA 平板上，每个浓度梯度进行3 次重复，倒置于25 ℃恒温培养箱中培养，培养5～8 d，挑选菌落形态特征有明显差异的单菌落接于PDA 培养基上进行纯化并编号。

生防真菌的筛选：将活化后的层出镰刀菌菌饼（6 mm）置于PDA 平板一侧，同时在右侧3 cm 处接种纯化后的待选菌种进行对峙培养[21]，每个菌落处理3 个重复。放置于28 ℃恒温培养箱中培养，5 d 后运用十字交叉法进行抑制率的计算[22]。抑制率（%）=（对照菌落生长半径—处理菌落生长半径）/对照菌落生长半径×100。

生防真菌RS05 的鉴定：取新鲜菌体，采用DNA 提取试剂盒提取真菌DNA，采用引物ITS1 和ITS4[23]、EF1-526F 和EF1-1567R[24]、frpb2-5f 和frpb2-7cr[25]进行分子检测，各序列上传至NCBI GenBank。PCR 扩增反应体系如表2 所示，取DNA marker 和PCR 反应产物各5 μL，依次小心加入点样孔中，设置电泳仪电压为120 V，电泳25 min。电泳结束后，将凝胶取下置于凝胶电泳图像分析系统观察PCR 产物片段大小并扫描拍摄电泳图。PCR 产物送往成都擎科生物技术有限公司进行测序，并登陆NCBI GenBank 数据库分析比较所得各个基因的同源性，根据比对结果确定建树用序列集，通过多基因联合建树分析，运用MEGA11做同源性分析并用邻接法构建系统发育树，确定目标真菌的系统进化地位。

表2 真菌目的基因序列的PCR 扩增反应体系及条件Table 2 System and condition of PCR amplification of fungal target gene sequence

1.3 基础培养基的筛选

将活化的生防真菌RS05 接种到PDA 培养基、PSA 培养基、PMA 培养基、Czpeak 培养基、Richard培养基、孟加拉红培养基、燕麦片琼脂培养基、胡萝卜培琼脂培养基、番茄琼脂培养基中，培养5～8 d，根据1.2 计算抑制率，运用血球计数板进行孢子数的计数确定出最佳基础培养基。

1.4 发酵条件的优化

将所得的基础培养基制作成液体培养基，采用单因素试验，对接种量、发酵时间、pH、温度、摇床转速、光照条件等进行不同梯度的测定，根据孢子数和抑制率来确定最佳发酵条件。各因素梯度如下：（1）接种量：2%、4%、6%、8%、10%、12%和14%；（2）pH：4、5、6、7、8、9 和10；（3）发酵时间：2、4、6、8、10 和12 d；（4）温度：22 ℃、23 ℃、24 ℃、25 ℃、26 ℃、27 ℃、28 ℃、29 ℃和30 ℃；（5）摇床转速：80、100、120、140、160、180、200 和220 r/min；（6）光照：全光照、全黑暗、12 h光照12 h 黑暗。

1.5 生防真菌RS05 水分散粒剂的制备及质量检测

1.5.1 载体的筛选 将红薯粉、糯米粉、玉米渣、生燕麦片、高岭土、硅藻土、活性炭、硅胶、凹凸棒土、木屑等分别按5%的浓度加入到最佳液体培养基中，灭菌后接入最适接种量的种子液。将没有加入载体的最佳培养基设置为对照。在28 ℃、180 r/min 的摇床中培养6 d 后抽取发酵液用血球计数板进行计数，每处理3 个重复，根据孢子数确定最佳载体。

1.5.2 紫外保护剂的筛选 将荧光素钠、抗坏血酸、腐殖酸、糊精以3000 μg/mL（0.3%）加入最佳液体培养基中，灭菌后接入最适接种量的种子液。设置对照CK1：经紫外不加紫外保护剂、CK2：不经紫外不加紫外保护剂。CK3：不经紫外加紫外保护剂。放置于28 ℃、180 r/min 摇床，待锥形瓶内种子液与液体培养基混匀后取出。置于（38 w，波长365 nm）的紫外灯下照射2 min 后置于28 ℃、180 r/min 摇床培养6 d后取发酵液用血球计数板进行计数，每处理3 个重复。确定了最佳种类后，对其进行浓度梯度筛选，设置为0.1%、0.3%、0.5%和0.7%，在28 ℃、180 r/min 的摇床中培养6 d 后取发酵液用血球计数板进行计数，每处理3 个重复，根据孢子数确定紫外保护剂最佳浓度。

1.5.3 润湿剂的筛选 将十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、拉开粉BX、吐温20 以（30000 μg/mL）3%添加量加入最佳液体培养基中，灭菌后接入最适接种量的种子液。于28 ℃、180 r/min 摇床培养6 d 后取发酵液用血球计数板进行计数，每处理3 个重复。根据孢子数和润湿时间测定选出最适宜的润湿剂种类。润湿时间按GB/T5451-2001[26]执行（≤1 min）。确定种类后，对润湿剂进行浓度梯度筛选，设置为1%、3%、5%、7%，在28 ℃、180 r/min 的摇床中培养6 d 后取发酵液用血球计数板进行计数，每组处理三个重复，根据孢子数确定润湿剂的最佳浓度。

1.5.4 稳定剂的筛选 取碳酸钙、磷酸二氢钾、硫酸钙、磷酸钙分别以0.5%加入最佳固体培养基，灭菌后用接种铲将真菌菌饼（6 mm）接种到上述平板上。每组处理设3 个重复，于28 ℃培养箱中培养5 d 后，根据孢子数确定一种最佳稳定剂。然后将选出的稳定剂以0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%的浓度梯度加入最适培养基，再次重复上述试验。根据孢子数确定稳定剂的最佳浓度。

1.5.5 黏结剂的筛选 取可溶性淀粉、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯基吡咯烷酮4 种不同类型的黏结剂以4%加入最佳固体培养基，筛选方法同稳定剂的筛选。浓度梯度为1%、3%、5%、7%，筛选方法同稳定剂的筛选。

1.5.6 崩解剂的筛选 将5%尿素、氯化钠、海藻酸钠、硫酸钠将载体、分别与孢子悬浮液（1×1010cfu/mL）、紫外保护剂、润湿剂、稳定剂、黏结剂混合后制成粒剂。采用刻度量筒试验法测定其崩解时间，根据崩解时间长短筛选适合的崩解剂[27]。然后将适宜的唯一崩解剂按1%、3%、5%、7%的浓度梯度进行与稳定剂、黏结剂的相同实验，选出最适宜的崩解剂浓度。

1.5.7 水分散粒剂的制备 将所筛选的润湿剂、紫外保护剂、稳定剂、黏结剂、崩解剂按照所筛选的最佳浓度与20%孢子液（1.8×1010cfu/mL）混合，载体补足100%，加水稀释混匀到一定黏度运用沃隆颗粒机WL-150 进行挤压造粒，得到1.5 mm×（2～3 mm）的粒剂。

1.5.8 水分散粒剂质量指标的检测 （1）润湿时间：参考GB/T5451-85[26]，重复5 次。（2）悬浮率：按照GB/T14825-93[28]，重复3 次。悬浮率（%）＝上悬液滤质千重/（上悬液滤质干重＋下悬液滤质干重）×100。（3）含孢量：称取0.01 g 收获的生防真菌发酵料分生孢子粉悬于10 mL 0.5%吐温80 溶液中，磁力搅拌30 min，用血球计数板测定孢子数，重复3 次。（4）pH：参考GB/T1601-1993[29]。（5）起泡性：参考GB/T 28137-2011[30]。（6）崩解性：将0.5 g 样品颗粒倒入含有90 mL 蒸馏水的100 mL 具塞量筒中，塞住筒口，夹住量筒的中部，以8 r/min 的速度绕中心旋转，记下样品在水中完全崩解的时间。（7）热贮稳定性：参考GB/T 19136-2003[31]。按照上述相同的方法测定pH、起泡性、等指标。

1.6 盆栽防效试验

在温度为25 ℃～28 ℃，相对湿度为70%～80%的温室大棚内进行。将两年生杂交竹栽至塑料培育盆（40 cm×30 cm×38 cm）。盆栽土壤基质经甲醛消毒（甲醛50 mL/m2，加水6～12 L，喷洒处理）后按营养土：普通土壤：蛭石=6∶2∶1 进行混合[32]。共设置9 个处理，水分散粒剂分别稀释至50 倍、100倍、200 倍、500 倍、1000 倍；CK1：化学可湿性粉剂40%五硝·多菌灵（江西中讯农化有限公司）稀释1000 倍；CK2：化学水分散粒剂30%甲霜·噁霉灵（河北中保绿农作物科技有限公司）稀释1000 倍；CK3：生防可湿性粉剂106cfu/g 寡雄腐霉菌（捷克生物制剂股份有限公司）稀释1000 倍；CK4：无菌水。将撑×绿杂交竹分成3 组，每组每处理5 株（共计405 株）：（1）先用106cfu/mL 的病原孢子液5 mL/株进行灌根[33]处理，15 d 后灌根上述5 种浓度的水分散粒剂和4 种对照试剂各50 mL/株；（2）先灌根上述5 种浓度的水分散粒剂和4 种对照试剂各50 mL/株，15 d 后灌根106cfu/mL 的病原孢子液5 mL/株；（3）同时灌根106cfu/mL 的病原孢子液5 mL/株和上述5 种浓度的水分散粒剂和4 种对照试剂各50 mL/株。每组试验重复3 次。30 d 后观察发病情况，计算发病率、病情指数、防治效果，病情指数分级标准如表3 所示。发病率（%）=发病株数/总株数×100；病情指数＝Σ（病级数×该病级植株数）/（最大病级数×植株总株数）×100，防治效果（%）＝（对照组病情指数－处理组病情指数）/对照病情指数×100。

表3 撑×绿杂交竹基腐病病情指数分级标准Table 3 B.pervariabilis ×D.grandis base rot disease index

1.7 数据统计与分析

抑菌率以及孢子数量统计等数据采用Microsoft Excel 2020 进行；应用SPSS 19.0 软件邓肯氏新复极差多重比较法对试验数据进行显著性差异分析；采用GraphPad Prism 8 进行统计图分析。

2 结果与分析

2.1 生防真菌分离筛选结果

从土壤中分离得到菌株20 个，对峙培养后不同菌株对层出镰刀菌的抑制率如表4 所示，其中RS05 菌株对层出镰刀菌抑制率最高，达到52%（图1A）。显微观察拮抗带如图1B、C 所示，层出镰刀菌菌丝被RS05 缠绕，且发生断裂。故确定RS05 菌株为生防真菌。

图1 菌株RS05 对峙培养及显微观察Fig.1 Stand-off culture and microscopic observation of strain RS05

表4 不同菌株对层出镰刀菌的抑制率Table 4 Inhibition rate of different strains to F.prolifertum

2.2 生防真菌RS05 的鉴定

菌株RS05 菌落正面白色，反面绿色，气生菌丝相对发达，5 d 左右中心开始色素堆积，并布满灰绿色粉末，为产生的大量分生孢子（图2A）；显微形态（图2B）所示，分生孢子梗基部粗短的可育侧枝和桶形至安瓶形瓶梗，分生孢子梗具有主轴，宽线状分枝少（图2B a）。分生孢子为光滑的长方形至窄椭圆形，大小为2～5 μm（图2B b）。综上，形态学初步鉴定为木霉菌。

图2 螺旋木霉RS05 的形态学与分子生物学鉴定结果Fig.2 Identification results of Morphology and molecular biology of T.spiralis RS05

PCR 反应后，分别得到长度为620、329 和1137 bp 的DNA 片段（图2C）。将各序列递交GenBank数据库获得登录号（ITS，K605030、TEF1，OK905444、RPB2，OK905445）。通过多基因联合建树分析（图2D），可以看出RS05 与螺旋木霉T.spiraleTAMA022 以100%的基因核苷酸序列相似性和较高的自展值支持聚为1 个分支，而与其他木霉菌相距较远，表明RS05 与螺旋木霉的亲缘关系最近，并保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4001。结合形态学鉴定，将RS05鉴定为螺旋木霉。

2.3 螺旋木霉RS05 基础培养基的筛选

结果显示（表5），确定最佳基础培养基为PSA，第3 d 在该培养基上菌落已长满，第5 d 孢子数达到1.46×1010cfu/mL。

表5 螺旋木霉RS05 在不同培养基上第5 d 的菌落直径和孢子数Table 5 Colony diameter and sporulation of T.spiralis RS05 on different medium on the fifth day

2.4 发酵条件的优化

由（图3A）可以看出，随着接种量增加，RS05 抑制率和孢子数逐渐增加，当接种量增长至8%时，抑制率和孢子数达到峰值，且与更高接种量差异不显著。pH 6 时，抑制率和孢子数均为最高（图3B）。随着发酵天数的增加，抑制率和孢子数逐渐增加，从第6 d 开始，抑制率和孢子数均开始出现增长缓慢（图3C）。温度对生防真菌抑制率和孢子数的影响并不显著，当温度为26 ℃～27 ℃时相对最佳（图3D）。随着摇床转速的增加，抑制率和孢子数相应增加，当转速在180 r/min 后，继续提高，抑制率和孢子数增长不明显（图3E）。光照对RS05 菌抑制率和孢子数的影响较大，随着光照的增加，二者均呈现上升趋势（图3F）。综上所述，最优发酵条件为：8%接种量、pH=6、发酵6 d、转速180 r/min、在26 ℃～27 ℃下全光照培养。

图3 不同发酵条件优化汇总图Fig.3 Summary of optimization of different fermentation conditions

2.5 载体和助剂的筛选结果

图4A 所示，添加高岭土、硅藻土、硅胶3 种载体，螺旋木霉RS05 的产孢量均为1010cfu/mL 级，显著高于其他载体。且硅胶经济成本较低，故确定硅胶为水分散粒剂的最佳载体。

图4 载体与不同助剂对螺旋木霉RS05 孢子数的影响Fig.4 Effect of carrier and different auxiliaries on spore count of T.spiralis RS05

紫外保护剂初筛结果如图4B 所示，添加抗坏血酸和糊精RS05 的孢子数略低于CK2（1.39×1010cfu/mL），荧光素钠（9.96×108cfu/mL）明显抑制RS05 的产孢。加入糊精的RS05 孢子数达1.29×1010cfu/mL，显著高于添加抗坏血酸（8.23×109cfu/mL），可以得出4 种紫外保护剂中糊精最利于RS05 的产孢作用，且可以保护RS05 在紫外照射之后孢子数的骤减，故初筛确定紫外保护剂为糊精。由图4C 可以看出添加吐温20RS05 的孢子数最高，为1.27×1010cfu/mL，初选吐温20 为最佳润湿剂。图4D 所示，加入碳酸钙RS05 的孢子数最高（1.41×1010cfu/mL），初选碳酸钙为最佳稳定剂。图4E 所示，加入可溶性淀粉RS05 的孢子数最高（1.48×1010cfu/mL），初筛确定黏结剂为可溶性淀粉。四种崩解剂的崩解时间均满足行业标注，且图4F 所示，加入氯化钠RS05 的孢子数最高（1.38×1010cfu/mL），故初筛确定氯化钠为最佳崩解剂。

紫外保护剂糊精复筛结果如图5A 所示，各浓度梯度差异不大，当浓度为0.3%时RS05 有最大孢子数（1.42×1010cfu/mL），故确定紫外保护剂糊精浓度为0.3%。润湿剂吐温20 各浓度梯度差异不大，当吐温20 浓度为1%和、3%、5%时各浓度梯度差异不显著，选取中间3%浓度梯度为润湿剂的最适浓度梯度；随着稳定剂碳酸钙浓度的增加，RS05 的孢子数增加，当其浓度为0.3%时，孢子数相对达到最大值（1.48×1010cfu/mL），与其他梯度差异显著，之后孢子数逐渐呈下降趋势（图5C），故确定稳定剂碳酸钙的最佳浓度为0.3%。随着黏结剂可溶性淀粉浓度的增加，RS05 的孢子数增加，当黏结剂可溶性淀粉浓度为3%时，孢子数相对达到最大值（1.51×1010cfu/mL），之后随着可溶性淀粉含量的增加，孢子数逐渐下降（图5D），故确定黏结剂可溶性淀粉的最佳浓度为3%。随着崩解剂氯化钠浓度的增加，RS05 的孢子数增加，当浓度为5%时，孢子数相对达到最大值（1.38×1010cfu/mL），之后随着氯化钠浓度的增加，孢子数逐渐明显下降（图5E），故确定崩解剂氯化钠的最佳浓度为5%。

图5 不同助剂浓度梯度筛选试验Fig.5 Concentration gradient screening test of different auxiliaries

2.6 水分散粒剂质量检测

水分散粒剂制备完成后对其进行质量检测，如表6 所示，质量检测均达到国家标准，可用于下一步盆栽防效试验。

2.7 盆栽防效试验

如表7 所示，无菌水处理撑×绿杂交竹基腐病发病率在62.3%左右，经过药剂处理发病率显著降低，其中五硝·多菌灵和甲霜·噁霉灵效果最好，发病率降低至7%和9%左右，市售生防可湿性粉剂寡雄腐霉菌为42.3%。从制剂浓度看，螺旋木霉RS05 水分散粒剂稀释倍数为200 倍以下时发病率最高不超过27%，防治效果在89%～94%之间，该制剂浓度防治效果略高于化学制剂，显著高于同类生防制剂；500 倍液防效（74%）也高于生防制剂。从不同处理组看，先接种病原（第1 组）和先接种水分散粒剂和对照试剂（第3 组）病情指数低、防效好，差异不显著，说明螺旋木霉RS05 水分散粒剂既可有效治疗撑×绿杂交竹基腐病也可预防该病。综上所述，在生产应用中可以用该制剂200-500 倍液直接灌根达到保护杂交竹的目的，也可以在杂交竹产生基腐病时施用100～200 倍液防治基腐病进一步蔓延。

表7 盆栽试验发病率、病情指数、防治效果汇总表Table 7 Summary table of pot experiment incidence, disease index and control effect

3 讨论

撑×绿杂交竹基腐病是一种新型土传病害，现目前对于此类病害的防治以化学措施为主，随着人们对绿色生活的要求，化学农药的危害也更受重视，生物防治则显得愈加重要。因此开发环境友好、防效较高的生防制剂具有非常重要的现实意义。本试验通过对病原菌层出镰刀菌所在地的健康杂交竹根际土中分离出20 种真菌；并分别与层出镰刀菌进行对峙培养，筛选出对层出镰刀菌具有52%抑制作用的生防真菌；通过形态学和分子生物学的联合鉴定，确定为螺旋木霉RS05。进一步显微观察对层出镰刀菌菌丝的抑制作用，与前人在木霉对辣椒疫霉菌Phytophthoracapsicum、茄腐镰刀菌F.solanum、灰葡萄孢菌Botrytiscinerea[34]、尖孢镰刀菌、接骨镰刀菌F.osteonicum[35]的生防作用结果相似，可以推断螺旋木霉RS05 对层出镰刀菌具有重寄生、竞争等作用，但其具体生防机制还需要更深入研究。

为开发对层出镰刀菌具有抑制作用的菌剂，必须筛选出能够在适宜的条件下能快速获得大量螺旋木霉RS05 孢子的发酵条件。本试验确定了PSA 为螺旋木霉RS05 的基础培养基，最佳发酵条件为：8%接种量、pH=6、摇床转速180 r/min、26 ℃～27 ℃下全光照发酵6 d，此条件下，产孢量从基础培养基的1.46×1010cfu/mL提高至1.8×1010cfu/mL。相较于其他相关研究，本试验在产孢数量上均大于长枝木霉T6（8.4×108cfu/mL）[36]、棘孢木霉（4.48×109cfu/mL）和绿色木霉（4.48×109cfu/mL）[37]，本试验的工艺仅需要制作更少的孢子悬浮液便能达到相同甚至更高数量级的孢子数，且接种量和发酵时间均小于以上3 种木霉菌剂，增加产孢量的同时降低了发酵时间和培养周期。通过对生防真菌发酵条件的优化，对病原层出镰刀菌的抑制率也从52%提高到了70%，高于已有报道的螺旋木霉对尖孢镰刀菌的抑制率64.57%[17]，且显著高于细菌菌株YM-8对层出镰刀菌的抑制率41.36%[38]。

盆栽试验中螺旋木霉RS05 水分散粒剂200 倍及以下稀释液对撑×绿杂交竹基腐病的防效不低于88%，在其他竹类根腐病防治中，化学农药效果一般为59%～75%[39,40]，本试验结果显著优于同类病害防效的报道。另外，与深绿木霉水分散粒剂防治黄瓜枯萎病的防效（80.95%）[41]相比，螺旋木霉RS05 水分散粒剂所展现的防效也较为突出。从制剂质量检测结果可知，RS05 水分散粒剂各项结果均比长枝木霉水分散粒剂[42]、哈茨木霉水分散粒剂[43]优异，润湿时间短、稳定性强、悬浮率高、崩解时间短。另外，RS05 水分散粒剂200 倍稀释液防效略高于化学水分散粒剂甲霜.噁霉灵、显著高于生防可湿性粉剂寡雄腐霉菌。可见该制剂在杂交竹基腐病及层出镰刀菌引起的其他植物病害上具有良好的应用前景。在后续研究中，将进一步研究螺旋木霉生防真菌剂在大田中的病害防治效果，并扩大防治对象范围，以期为该制剂的开发与应用提供新的借鉴。