两种防冰剂对喷气燃料中微生物抑菌性能对比

2023-12-25胡泽祥张世堂娄国生高盛嵩

石油化工应用 2023年11期

胡泽祥，张世堂，娄国生，高盛嵩，陈爽

（1.92228 部队，北京 100072；2.91286 部队，山东青岛 266021；3.中国石油大学（华东）化学化工学院，山东青岛 266580）

燃料中的微生物污染会导致燃料洁净性、燃烧性与流动性等效果下降[1－2]；同时会引起燃料储存、供给系统部件堵塞，干扰计量系统正常工作[3]；还会加剧油箱、储罐和管道的腐蚀，使内部涂层脱落、内壁生锈，产生大量淤泥[4－5]。在20 世纪30 年代，燃料中微生物污染的问题引起了各燃料管理机构的关注[6]，微生物污染影响燃料使用与飞机飞行的事件在国内外均有记录[7－8]。因微生物个体小、分布范围广、生长繁殖快，燃料中的微生物难以彻底去除[9]。为防止微生物污染的危害，国内外所有标准规范中均含有针对微生物污染防治的手段[6－7，10]。彻底的杀菌工作需要采用具有特殊要求的杀菌剂，杀菌前需排出全部燃料，杀菌后需多次清洗处理并干燥。杀菌手段往往是一种“休克疗法”，当燃料储存、供应系统发生严重的微生物污染事故时，才会采取繁琐复杂的杀菌手段[10-11]。做好日常质量管理、预防微生物生长繁殖是解决微生物污染的最优方法[11]。

防冰剂是一种较为常见的飞机喷气燃料添加剂，其主要功能是降低水分的冰点，防止喷气燃料中产生冰晶。防冰剂主要为醇醚类化合物，既能溶于水，又能溶于燃料。因为防冰剂能与水混溶且具备一定的细胞毒性，除防止冰晶产生的作用外，防冰剂还具有抑制微生物生长繁殖的作用。

国内对于防冰剂的使用方法主要参考美国相关标准，早期采用乙二醇单甲醚（EGME）作为防冰剂[12]，但因EGME 存在降低燃料闪点、毒性较大等问题，被二乙二醇单甲醚（DiEGME）取代[13]。目前国内以DiEGME作为主要采用的防冰剂，有研究指出，DiEGME 蒸气压较高，在接触壁面冷凝后产生的高浓度液滴会引起涂层溶胀并剥落，影响飞机油箱的正常使用并导致输送管线堵塞[14]。三乙二醇单甲醚（TriEGME）相比于DiEGME，降低冰点的效果相近且对于涂层的影响很小[15]。目前，TriEGME 防止冰晶产生的作用已经得到验证，但其抑制微生物生长繁殖的作用仍待探究，若TriEGME 具备与DiEGME 相近的抑菌性能，则存在代替DiEGME，作为更优质的防冰剂应用于实际。

本研究利用某油库的喷气燃料油样分别在细菌、真菌培养条件下制备原菌液。当光波波长为600 nm时，菌液中微生物的数量与吸收的光密度OD（optical density）存在线性关系，可以用OD600表示。通过吸光光度法，快速测定菌液的吸光度以表达微生物数量。测定DiEGME 与TriEGME 分别对于喷气燃料样品中细菌、真菌的抑菌性能，并进行对比分析，考察两种防冰剂抑制微生物生长繁殖的能力。

1 实验

1.1 实验材料与仪器

沿海地区某油库喷气燃料油样；鱼粉蛋白胨，国药集团化学试剂有限公司；D（+）-无水葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司；胰酪大豆胨液体培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；二乙二醇单甲醚，上海麦克林生化科技股份有限公司；三乙二醇单甲醚，上海麦克林生化科技股份有限公司。

恒温水浴加热器DF-101S，巩义市予华仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱FCD-3000，上海琅玕实验设备有限公司；电子天平ME204TE/02，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；数显气浴恒温振荡器CHA-SA，青岛蓝特恩科教仪器设备有限公司；紫外可见光分光光度计752N，上海精密科学仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器YXQ-LB-100SⅡ，上海博迅实业有限公司；超声波清洗仪KQ-300KDE，昆山市超声仪器有限公司；双人超净工作台SW-CJ-2G，上海沪净医疗器械有限公司；奥林巴斯生物显微镜CX31，奥林巴斯（中国）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌、真菌培养基配制称取30 g 胰酪大豆胨液体培养基试剂，加入纯化水，在恒温50 ℃下水浴搅拌至溶解，待冷却后定容为1 L 溶液，分装后于121 ℃下高压灭菌15 min，作为细菌培养基备用。同理，称取10 g 鱼粉蛋白胨与40 g 无水葡萄糖试剂，加入纯化水，在恒温50 ℃下水浴搅拌至溶解，待冷却后定容为1 L 溶液，分装后于115 ℃下高压灭菌15 min，作为真菌培养基备用[16]。

1.2.2 细菌、真菌原菌液制备将现场取得喷气燃料油样置于灭菌后试剂瓶中密封，轻微振荡使其混合均匀。在双人超净工作台SW-CJ-2G 中用移液枪移取1 mL未过滤的喷气燃料，加入到灭菌后的500 mL 细菌培养基中。同理将1 mL 未过滤的喷气燃料加入到500 mL真菌培养基中。并将两种培养基置于恒温振荡培养箱中分别在对应温度（细菌培养基37 ℃、真菌培养基28 ℃）下培养5 d。培养后分别得到喷气燃料样品中细菌与真菌（以下分别简称为细菌、真菌）的原菌液。轻微振荡混合均匀后，用移液枪移取200 μL 原菌液制成玻片标本，采用奥林巴斯生物显微镜CX31 镜检观察形态加以验证。

1.2.3 不同体积分数DiEGME 抑菌性能测定在无菌环境中，将DiEGME 作为防冰剂以体积分数10%、20%、30%、40%、50%、60%的比例加入到细菌培养基中，于250 mL 锥形瓶中配制100 mL 溶液，并取100 mL无DiEGME 的细菌培养基于250 mL 锥形瓶中作为对照样，移液枪移取10 mL 细菌原菌液加入到每个锥形瓶中，采用透气膜与耐热橡皮筋封口，将上述7 份含不同体积分数防冰剂的培养基作为一组，准备三组作为平行实验组，在后续测定过程中取三组的平均值以消除误差，将上述三组培养基记为DiEGME 细菌培养组。同理将DiEGME 加入到真菌培养基中，并取100 mL 真菌培养基作为对照并封口，准备三组作为平行实验组，记为DiEGME 真菌培养组。

通过紫外可见光分光光度计752N，分别测定DiEGME 细菌培养组、DiEGME 真菌培养组在光波波长为600 nm 时的吸光度（OD600），重复测定3 次取平均值以消除误差，并记录为0 h 下OD600。将DiEGME 细菌培养组、DiEGME 真菌培养组分别在37 ℃（细菌培养组）、28 ℃（真菌培养组）恒温振荡培养箱中培养，并依次在2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h 时停止振荡，取出样品测定OD600。

为了准确分析DiEGME 能实现有效抑菌的浓度，再次按照上述实验方法，加入体积分数12%、14%、16%、18%的DiEGME 到细菌培养基中，重复实验，测定OD600，以确定DiEGME 具体的抑菌浓度。

1.2.4 不同体积分数TriEGME 抑菌性能测定同理，按照1.2.3 中相同操作，将TriEGME 作为防冰剂进行相同实验操作，得到TriEGME 细菌培养组与TriEGME真菌培养组，并测定24 h 内OD600变化。

2 结果与讨论

2.1 生物显微镜镜检结果

采用1.2.2 所述方法在实验室中培养细菌和真菌，制备细菌、真菌原菌液，采用生物显微镜对原菌液的细菌、真菌玻片进行观察，通过微生物细胞形态，确定所采用的菌液制备方法可靠有效以及细菌、真菌原菌液中无相互掺杂干扰。生物显微镜镜检结果见图1、图2。

图1 细菌原菌液镜检结果

图2 真菌原菌液镜检结果

通过镜检结果可以看出，细菌玻片中存在数量较多形态与杆菌相似的细胞，并无真菌等其他形态微生物。真菌玻片中存在明显的菌丝结构，基本不存在其他类型微生物。可以认为实验室条件下的细菌、真菌培养方法具有可行性，且基本无细菌、真菌相互掺杂干扰的情况。

2.2 DiEGME 抑菌性能测定

2.2.1 DiEGME 对于细菌的抑制效果按照1.2.3 所述的方法，测定24 h 内含0、10%、20%、30%、40%、50%、60%体积分数DiEGME 的细菌培养基的OD600，结果见图3。

图3 DiEGME 细菌培养组24 h 内OD600 结果

由图3 可见，无DiEGME 的细菌培养基OD600在0～2 h 内缓慢增大，在2～8 h 内呈对数形迅速增大，在8～12 h 内OD600趋于稳定，在12 h 后OD600逐渐减小。10%体积分数DiEGME 的细菌培养基在12 h 内OD600相对稳定，无明显变化，在12 h 后OD600逐渐增大，在24 h 时具有继续增大的趋势。而其他更高体积分数DiEGME 的细菌培养基OD600在24 h 内稳定在初始值附近，并略微减小，与12 h 内10%体积分数DiEGME的细菌培养基处于同一水平。

10%体积分数的DiEGME 在12 h 内对细菌具备一定的抑菌性能，OD600与其他体积分数下处于同一水平，但超过12 h 后DiEGME 细菌生长繁殖开始变得明显，从而表现为OD600增加。说明10%体积分数下的DiEGME 无法对细菌产生持续有效的抑菌作用。

为确定DiEGME 对于燃料中细菌具体的抑菌浓度，测定24 h 内含12%、14%、16%、18%体积分数DiEGME 的细菌培养基的OD600，结果见图4。

图4 10%～20%体积分数DiEGME 细菌培养组24 h 内OD600 结果

DiEGME 体积分数达到12%时，前16 h 内，细菌无明显的生长繁殖，在16 h 后细菌生长繁殖逐渐明显，但速度相对慢于加入10%体积分数DiEGME 时。DiEGME 体积分数达到14%及以上时，对细菌可以发挥充足的抑菌性能，维持OD600稳定于0.1 以下，在24 h内，随着时间的增加，OD600基本不变。说明DiEGME 在体积分数达到14%及以上时，可以在24 h 内有效抑制细菌生长繁殖。

2.2.2 DiEGME 对于真菌的抑制效果测定24 h 内含0、10%、20%、30%、40%、50%、60%体积分数DiEGME 的真菌培养基的OD600，结果见图5。

图5 DiEGME 真菌培养组24 h 内OD600 结果

由图5 可见，无DiEGME 的真菌培养基OD600在0～4 h 内缓慢增大，在4～12 h 内呈对数形迅速增大，在12 h 后OD600趋于稳定，存在略微波动。添加10%体积分数DiEGME 的真菌培养基相对稳定，无明显变化。总体来看，不同体积分数DiEGME 的真菌培养基OD600在24 h 内稳定在初始值附近。

通过OD600结果可以看出，对于实验室条件下培养的真菌，在无DiEGME 抑制时，在10 h 达到最大生长速度，培养14 h 后真菌数量达到稳定。

DiEGME 体积分数达到10%及以上时，对于真菌可以发挥充足的抑菌性能，维持OD600稳定于0.1 以下。说明DiEGME 在体积分数达到10%及以上时，可以在24 h 内有效抑制真菌生长繁殖，且相比来说，DiEGME 抑制真菌生长繁殖的效果优于抑制细菌。

2.3 TriEGME 抑菌性能测定

2.3.1 TriEGME 对于细菌的抑制效果测定24 h 内含0、10%、20%、30%、40%、50%、60% 体积分数TriEGME 的细菌培养基的OD600，结果见图6。

图6 TriEGME 细菌培养组24 h 内OD600 结果

由图6 可见，无TriEGME 的细菌培养基OD600变化规律与无DiEGME 的细菌培养基一致。10%体积分数TriEGME 的细菌培养基在8 h 内OD600相对稳定，无明显变化，8～12 h 时OD600逐渐增大，12～20 h 时OD600呈指数形增大，在20 h 后趋于稳定。而其他更高体积分数TriEGME 的细菌培养基OD600在24 h 内稳定在初始值附近，与8 h 内10%体积分数TriEGME 的细菌培养基处于同一水平。

10%体积分数的TriEGME 在8 h 内对细菌具备一定的抑菌性能，OD600与其他体积分数下处于同一水平，但超过8 h 后TriEGME 无法抑制细菌生长繁殖，且相比于DiEGME 抑菌性能较低，表现为OD600以高于加入DiEGME 的细菌培养基的速度迅速增大，并在20 h 后趋于稳定。说明10%体积分数下的TriEGME 无法对细菌产生持续有效的抑菌作用。虽然细菌生长进入稳定期时数量少于未添加TriEGME 的细菌培养基，但仍然出现细菌大量生长繁殖的情况。与添加10%DiEGME 相比，采用10%TriEGME 进行抑制生长的细菌，其生长繁殖速度更快并出现细菌生长繁殖的稳定期，TriEGME 抑菌性能略弱于DiEGME。

为确定TriEGME 对于燃料中细菌具体的抑菌浓度，测定24 h 内含12%、14%、16%、18%体积分数TriEGME 的细菌培养基的OD600，结果见图7。

图7 10%～20%体积分数TriEGME 细菌培养组24 h 内OD600 结果

随着TriEGME 体积分数逐渐增大，细菌的生长繁殖速度减慢，在TriEGME 体积分数增大到12%、14%、16%，细菌开始出现明显生长繁殖的时间也延后至10、16、18 h，当TriEGME 体积分数达到18%时，OD600在24 h 内稳定维持于0.1 以下。说明TriEGME 在体积分数达到18%及以上时，可以在24 h 内有效抑制细菌生长繁殖。

2.3.2 TriEGME 对于真菌的抑制效果测定24 h 内含0、10%、20%、30%、40%、50%、60%体积分数TriEGME 的真菌培养基的OD600，结果见图8。