黑茶香气成分研究进展

2023-12-25石禾云张娅吴雪娇王超徐咏全张军通信作者

天津农学院学报 2023年5期

石禾云，张娅，吴雪娇，王超，徐咏全，张军，通信作者

（1. 天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300392；2. 天士力控股集团有限公司研究院，天津 300410；3. 湖南农业大学园艺学院，长沙 410125）

黑茶是六大茶类（绿茶、红茶、黄茶、白茶、青茶、黑茶）之一[1]。黑茶主要以鲜叶制成的毛茶为原料，经过渥堆发酵、压制、干燥等制成黑茶，不同黑茶加工工艺也有区别，如茯砖茶还需要“发花”等工艺形成独特的“菌花香”。黑茶发酵周期较长，微生物发酵较充分，属于后发酵茶，因其茶汤颜色呈黑褐色或黑色而得名[2]。黑茶包括六堡茶、康砖茶、普洱茶、青砖茶、茯砖茶等[3]。黑茶因其具有调节血脂[4]、增强肠道免疫力[5]等保健功效而深受消费者喜爱。随着现代人生活水平的提高以及健康意识的不断增强，大健康食品逐渐成为日常必需品。据统计，2019 年中国黑茶产量仅次于绿茶，位居第二[6]。香气是黑茶品质的重要影响因素，近年来关于黑茶香气的研究并不少，但缺乏系统性的整理分析，笔者将2017—2021 年有关黑茶香气的研究报道进行整理分析，以期为黑茶香气研究提供理论指导。

1 黑茶中挥发性成分的提取、检测技术研究进展

1.1 提取方法

香气富集方法涵盖了多种具有不同挥发性的化合物。黑茶香气提取回收的方法较多，如：超临界流体萃取（Supercritical fluid extraction，SFE）、搅拌棒吸附萃取（Stir bar adsorption extraction，SBSE）、微室/热提取器提取法（Microchamber/thermal extractor，μ-CTE）、溶剂辅助风味蒸发（Solvent assisted flavor evaporation，SAFE）、顶空蒸馏萃取（Headspace distillation extraction，HDE）等。目前比较常用的是同时蒸馏萃取法（Simultaneous distillation extraction，SDE）和顶空固相微萃取法（Headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）。见表1。

表1 近5 年黑茶提取、分析方法及检测出的主要香气物质研究进展

1.1.1 顶空固相微萃取法（HS-SPME）

HS-SPME 的萃取头尖端有一小段具有吸附能力的纤维涂层，萃取头有多种，常用的是50/30µm DVB/CAR/PDMS、65 µm PDMS/DVB、75 µm CAR/PDMS 等。工作时SPME 纤维暴露于样品顶部空间，将SPME 纤维下方的样品连续搅拌一段时间后，使吸附在SPME 纤维上的所有挥发性成分在气相色谱进样口处解吸附，通过气相色谱类仪器进行检测分析。HS-SPME 是一种简单、快速、无溶剂和低成本的提取技术，同时它也是一种具有良好的重复性、灵敏度和选择性的提取方法[7]，尤其对高挥发性化合物敏感。FENG 等[8]研究证明，与固相萃取（Solid phase extraction，SPE）和溶剂辅助风味蒸发萃取（SAFE）两种提取方法相比，HS-SPME 香气回收率很高，但由于纤维涂层的选择性吸附，使得SPME 富集的化合物相对浓度与顶部空间中的挥发性成分有显著偏差。此外，张文杰等[9]发现，HS-SPME 不适合提取高沸点化合物，萃取效果比较差。

1.1.2 同时蒸馏萃取法（SDE）

SDE 是将样品和水放入烧瓶中，并连接到SDE仪器的一侧，仪器的另一侧连接装有溶剂的烧瓶，通过加热溶剂和样品浸剂，挥发性化合物用乙醚等溶剂提取后，用无水硫酸钠干燥提取物，然后过滤浓缩，用气相色谱类仪器进行检测分析[10]。王利妍等[11]研究发现，使用SDE 法提取出的香气化合物重现性比较低，建议采用此方法提取香气物质时，应增加试验的重复次数或者改进提取方法等。此外，由于长时间高温提取，SDE 可能会改变样品中的一些挥发性成分[12]，导致检测结果与实际存在一定的偏差。

1.2 分析方法

目前，常用的黑茶香气化合物的检测分析方法有：气相色谱-质谱联用（Gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）、全二维气相色谱-飞行时间质谱联用（Comprehensive two-dimensional gas chromatograph-time of flight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS）、气相色谱-离子迁移谱（Gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）、气相色谱-嗅闻仪（Gas chromatography-olfactometry，GC-O）、电子鼻（Electronic nose, e-nose）等。见表1。

1.2.1 气相色谱-质谱联用（GC-MS）

GC-MS 是目前黑茶香气化合物检测分析中使用频率最高的一种检测分析技术，可实现对挥发性化合物的定性和定量。GC-MS 通常会结合相对气味活性值（Relative odor activity value，ROAV）或气味活性值（Odor activity value，OAV）一起使用，这种结合方法主要是考察各香气成分的贡献情况，从而筛选出关键性香气物质等。DENG 等[13]采用OAV方法发现了对普洱茶贡献最大的香气化合物。马士成等[14]采用ROAV 计算和GC-O-MS分析从六堡茶中确定了关键性香气成分。

1.2.2 全二维气相色谱-飞行时间质谱联用（GC×GC-TOFMS）

相比于GC-MS，GC×GC-TOFMS 是一种新兴的检测分析技术，对于香气成分检测具有更高的灵敏度、峰容量和分辨率。SHI 等[15]使用GC×GC-TOFMS 分别在茯砖茶和普洱茶中鉴定出373种和408 种主要芳香成分。DU 等[16]使用GC×GCTOFMS 评估喷雾干燥工艺生产的速溶普洱茶的挥发性成分，并与普洱茶进行比较，在速溶普洱茶和普洱茶中分别鉴定出208 种和204 种挥发物。从上述研究结果可以看出，GC×GC-TOFMS 对黑茶香气物质的检出数量明显比GC-MS 检出的数量高很多，足见其优势。

1.2.3 气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）

曾桥等[17]采用GC-IMS 技术对杜仲叶茯砖茶加工过程中挥发性成分进行测定，使用Gallery Plot插件绘制了挥发性物质离子迁移指纹谱图，共检出挥发性成分70 种，明确定性的有51 种，包括醛类、酮类、醇类、酯类、吡嗪类等。另外，李俊杰等[18]研究发现，GC-IMS 与HS-SPME-GC-MS 两种技术结合使用能够达到互补的效果，GC-IMS 检测出的成分为含量低的小分子物质，而HS-SPMEGC-MS 可以检测出含量较高的大分子物质，样品中挥发性组分的变化情况能被更全面地反映出来。

1.2.4 气相色谱-嗅闻仪（GC-O）

GC-O 是通过气相和人工嗅闻相结合的方式，确定香气物质的香气强度。通过不断稀释的方式，确定复杂体系中香气物质的香气强度，使用溶剂对挥发性组分进行稀释，结合GC-O 进行嗅闻，直至气相色谱流出物中不再嗅闻到气味，通常把最高的稀释度定义为风味稀释因子（Flavor dilution，FD）。其主要特点是通过人工嗅闻感官判断鉴别香气活性物质，对香气物质进行初步筛选，结合GC-MS定性定量，确定关键性香气成分[14]。张婷等[19]采用香气萃取稀释法将提取物以正己烷为溶剂进行4n倍稀释，采用GC-O 分析气味及强度，将FD值＞1 的提取物确定为康砖茶香气活性化合物，FD值≥16的提取物确定为康砖茶关键性香气成分。香气萃取稀释法的稀释倍数也可采用2n或者3n进行，且可以结合分流比进行研究[20]。

1.2.5 电子鼻（e-nose）

研究表明，电子鼻有气味传感器，气味是数字化的，它不仅可以辨别茶的香气，而且可以快速定位未知茶的年份等[21]。温立香等[22]研究证明，利用电子鼻建立判断六堡茶是否有陈香的识别模型是可行的。YANG 等[23]利用e-nose 和微室/热提取器（μ-CTE）并结合热解析与气相色谱-质谱联用（Thermal desorption coupled to gas chromatographymass spectrometry，TD-GC/MS）快速表征普洱茶中的挥发性化合物，可以有效区分不同品牌的普洱茶。

2 5 种黑茶香气成分研究进展

2.1 普洱茶

相比于其他黑茶，国内外对于普洱茶香气化合物的研究比较深入。普洱茶香气成分主要包括醛类、醇类、酮类、甲氧基苯类、碳氢类、酚类、酯类和含氮类等[39]，这一结果与佟文哲[20]、郑鹏程等[27]、赵苗苗等[40]、ZHANG 等[41]、李大雷等[42]的研究结果基本一致。普洱茶主要特征性香气成分如表1 所示。佟文哲[20]、高熳熳等[39]、李季等[43]均发现普洱茶香气成分中甲氧基苯类化合物含量最高。甲氧基苯类等主要贡献性香气成分在80 ℃萃取温度下累积峰面积最高，其次为70 ℃[44]，并且甲氧基苯的陈旧气味与甜香、花香和绿色气味具有相互掩蔽的作用。反式-β-紫罗兰酮的浓度越高，花香的强度越强，陈香越弱[10]。此外，普洱茶经过冲泡后，茶汤中的1，2，3-三甲氧基苯和1，2，4-三甲氧基苯含量明显降低[43]。DENG 等[13]发现，对普洱茶香气贡献较大的3 种化合物分别为：β-大马酮、1，2，3-三甲氧基苯和（E，E）-2，4-壬二烯醛。不同的普洱茶香气成分也有不同，花果香型和陈香型普洱茶主要香气成分及含量不同[34]。陈旧和有霉味的甲氧基苯对普洱熟茶的贡献最大，而有花香、甜味、木香的萜醇、萜酮和酚类化合物是普洱生茶中的主要气味[45]。

普洱茶原料（晒青毛茶）以醇类物质为主，发酵后1，2，3-三甲氧基苯、3，4，5-三甲氧基苯等杂氧化合物增加[11]。普洱茶的香气特征取决于其贮藏期限和贮藏条件（湿热或干冷环境）。在不同贮藏条件下所得的普洱茶香气差异较大，在干冷贮藏条件下，类胡萝卜素衍生物、苷类挥发物和酚类含量较高，具有清新、花香、甘甜的香气。在湿热贮藏条件下，茶叶含有更多的甲氧基苯类化合物，这对其“陈旧”和“木质”香气有很大贡献[46]。可见，湿热环境有助于微生物发酵，形成黑茶特有的香气成分。古树普洱生茶经长期（6 年及以上）贮藏后能提升其感官品质，可能与其具有花果香气息的醇类物质的降低和具有陈香气息的甲氧基苯类物质的升高有关[47]。生茶陈化过程中，不同贮藏地香气物质变化不同，贮藏在广东地区的普洱生茶香气物质种类复杂且变化比较剧烈，贮藏在新疆地区普洱生茶香气物质简单且变化迟缓[48]。造成这一结果的原因可能是由于两地气候环境不同，温湿度不一致等。何鲁南等[49]、罗美玲等[50]、张纪伟等[51]均发现，甲烷和硫化物等香气物质发生变化与普洱茶贮藏有关。陈保等[52]研究证明，随着翻堆次数的增加，不同普洱茶原料主要的香气成分变化一致，但酮类物质及芳樟醇氧化物I 和α-松油醇变化不同。此外，普洱茶制成普洱茶粉后香气发生了改变，普洱茶粉中香气以果香、花香、木香、草药香为主，陈香、仓味总香气强度明显低于普洱茶原料。原因是茶汤浓缩后部分香气物质存在于茶浓缩水中[53]。某些加工工艺会对香气成分造成影响，如脱酶和高压灭菌-压缩对挥发性组分影响较大，总挥发性成分含量急剧下降。脱酶处理使醛类的相对含量显著增加，而使烯烃的相对含量急剧降低。高压灭菌-压缩导致醛和酯的含量进一步降低，含氮化合物和酮的含量显著增加[54]。

2.2 茯砖茶

LI 等[12]、李俊杰等[18]、徐元昊[25]、郑鹏程等[27]、沈程文等[55]均提到茯砖茶主要香气特点为“菌花香”。郑鹏程等[27]研究认为，茯砖茶以醇类和芳香烃为主。在徐元昊[25]的研究中，手筑茯砖茶含量较高的成分是碳氢化合物、醇类、酯类。而湖南安化茯砖茶香味物质以醇类、酮类和醛类为主，这一结果与赵仁亮等[32]研究结果一致。沈程文等[55]研究发现，茯砖茶香气以菌香为主要特点，部分茯砖茶稍带沤味、烟气，欠纯正。赵仁亮等[32]对3个地区的茯砖茶进行研究，发现陕西茯砖茶带有高火香，杂环类化合物含量较高；湖南茯砖茶菌花香较明显，烯醛类物质含量最高；浙江茯砖茶略带青气，其低级脂肪醛含量较高。李俊杰等[18]发现，手筑茯砖茶气味特征表现为含药草香、木香、花果香的菌花香。发花和干燥过程中，挥发性组分含量和种类随时间的延长而增多，而以草木青辛气为特征的萜烯类含量和种类不断减少，以果香、药香、菌香为特征气味的醇类、酯类、酮类、醛类物质含量及种类不断增多。该结果与徐元昊[25]研究结果一致。曾桥等[17]以杜仲叶为原料制作茯砖茶，从6 个阶段样本中共检出挥发性成分70 种，明确定性的有51 种，香气物质变化规律与李俊杰等[18]、徐元昊[25]的研究结果基本一致。在茯砖茶中，苯甲醛和苯乙醛含量比普洱茶少将近1 倍，而壬醛和2-己烯醛的含量比普洱茶高2倍[15]。说明不同黑茶之间除了香气成分存在差异外，香气成分的含量也存在显著差异。

2.3 青砖茶

殷雨心等[56]研究发现，各品种青砖茶香气成分以醇类、醛类、酮类和烷烯烃类为主，该结果与郑鹏程等[27]、刘盼盼等[29]的研究结果一致。青砖茶主要香气成分见表1，此结果与郑鹏程等[27]关于青砖茶香气成分的研究部分一致。刘盼盼等[29]研究的青砖茶关键香气成分中相对含量较高的成分有己醛、芳樟醇、壬醛和甲苯[29]，但芳樟醇和甲苯却不在关键香气成分内，可见含量高的化合物其香气影响不一定大。青砖茶在渥堆发酵过程中挥发性成分增加，在陈化贮藏过程中有所减弱，但在陈化贮藏过程中产生了一些新的挥发性成分。4-（2，6，6-三甲基- 1-环己烯-1-基）-2-丁酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮和番红花醛被选为青砖茶的关键挥发性成分[57]。这一结果与刘盼盼等[29]的检测结果不一致，究其原因可能是由于原料、品种、加工工艺、生产年份等差异造成的。如ZHANG等[57]采用湖北赤壁种植的1 芽5、6 叶鲜叶于2016年加工制成的样品，而刘盼盼等[29]采用的是2015年出厂的湖北省不同厂家生产的多个样品。HU等[24]研究发现，青砖茶的特征香气成分可能与青砖茶的木香、药香等特征香型具有直接关系。此外，青砖茶香气受很多因素的影响，如特殊菌株、加工工艺等。接种N8.11-20（铜绿假单胞菌）发酵青砖茶，发现发酵过程中酚类、酮类、醇类主要成分有18 个，与普通菌种发酵的青砖茶略有不同。蒸汽导致酚类物质含量上升，酮类、醇类物质含量下降。在发酵过程中，酚类、酮类成分含量明显上升，醇类成分含量明显下降[58]。青砖茶在渥堆期间由于微生物的作用，使得烯醛、酮类、甲氧基苯类和呋喃类香气物质明显增加，醇类和酯类香气物质明显减少。同时还检测出对青砖茶不同加工阶段的风味变化有着重大贡献且OAV均值大于1 的12 种香气化合物[26]。另外，原料也是一个对香气成分很重要的影响因素，香气成分总量随着原料成熟度的增加而显著升高，用4 种不同成熟度原料（1 芽1 叶、1 芽2、3 叶、1 芽4、5 叶和修剪枝叶）制作的青砖茶中，1 芽1 叶原料青砖茶香气总量最低，修剪枝叶香气总量最高，1芽4、5 叶原料香气总量次之，二者制作出的青砖茶香气成分相似，但修剪枝叶氟含量超标。综合青砖茶香气品质和氟含量安全要求，选用以1 芽4叶为主的鲜叶作为青砖茶原料最佳[59]。

2.4 六堡茶

张芬等[60]研究发现，六堡茶在渥堆后香气成分中醛类、烯类的相对含量减少，而酯类、杂氧化合物的相对含量增加。黎敏等[61]采用传统工艺和现代工艺生产的六堡茶中共检出49 种挥发性香气成分，其中传统工艺六堡茶香气成分以醇类、醛类和酮类为主，现代工艺六堡茶以醛类和酮类为主，两种工艺六堡茶主要香气成分不同，（E，E）-2，4-庚二烯醛、β-紫罗酮、3，5-辛二烯-2-酮等物质在两种工艺六堡茶中的相对含量都较高。在郑鹏程等[27]的研究中，六堡茶香气以醇类和醛类为主，其中部分化合物分别在穆兵等[33]、黄林杰等[38]、温立香等[63]的研究结果中有所提到。柠檬烯在近几年关于六堡茶香气成分的研究中并未被提及，但在青砖茶香气成分的研究中被部分学者所发现[29，62]。温立香等[22]发现，甲基类化合物、醇酮类化合物、硫化物及氮氧化合物在区分六堡茶“有陈香”和“陈香不显”的两类香型茶中起主要作用，同时还检测出呈现“陈香”的5 个主要特征性芳香物质[63]。黄林杰等[38]研究出槟榔香的主要香气成分，见表1。从两者的研究中看出，α-雪松醇、β-芳樟醇两种化合物是六堡茶中显“槟榔香”和“陈香”的共有香气物质，说明同一化合物与其他不同化合物相混合能呈现出不一样的香气类型，成就不同香型的六堡茶。

2.5 康砖茶

郑鹏程等[27]研究发现，康砖茶香气纯正，以花香和木香为主，成分以酮类和醛类为主，含量较高的成分为1，2，3-三甲氧基苯、二氢猕猴桃内酯、2-乙基己醇、雪松醇和苯乙醛。经GC-O试验鉴定出7 个康砖茶关键香气成分（表1）[19]。甘甜等[64]选取3 个年份的康砖茶叶进行研究，共检测出75 种主要香气成分。挥发性化合物酯类、烯烃类及芳香类物质在贮藏11 年的雅安藏茶（康砖）中检测出较高的含量，极有可能对雅安藏茶陈香香气贡献巨大。康砖茶贮藏1～30 年间，特征香气成分数量先减少后增加，酯类和杂环类逐渐取代不饱和醛类、醇类和酚类成为康砖茶的重要赋香成分。贮藏1～6 年康砖茶中青粗气的主要赋香成分为：（E）-4-庚烯醛、（Z）-2-庚烯醛和愈创木酚，贮藏6 年样品中酚类物质种类和相对含量均增加。贮藏10 年样品中主要的赋香成分有：2，3-二甲基吡嗪、5-甲基-γ己内酯和2-乙基-1-己醇，表现为坚果香、甜香。低阈值的4-甲基苯酚是贮藏30 年康砖茶的重要香气成分，此时青粗气成分减弱或消失，药香明显，陈香中略带干药香。贮藏10 年是康砖茶香气特征从新茶向陈茶转变的重要转折点。贮藏10～22 年是形成陈年康砖茶的关键期。当贮藏25～30 年时，康砖茶香气和滋味的干果香或中药材香已经形成[65]。