几种环境因子对普通小球藻生长及磷利用率的影响

刘敏，于建霖，康会会，孔庆霞

（天津农学院 水产学院，天津 300392）

据悉，2016 年我国水产养殖产量达五千多万吨，为全国水产总量的74.5%[1]。高密度养殖是中国主要养殖模式，过多的残饵与粪便会导致养殖水域TN、TP、CODMn等偏高[2-4]，尾水处理问题急需解决，但水产养殖尾水污染程度较低且量大，很难有效处理[5]。氨氮、亚硝酸盐、磷等污染物在水产养殖尾水中最为常见[6]。焦隽对江苏省农村污水研究显示，水产养殖产生的TN 污染占总污染的11.57%，而51.12%则来自TP[7]。养殖尾水中磷的来源主要是养殖户投喂的饲料中杂带的饲料添加剂及其分解物，还有一部分来自水生生物的排泄物[8]。其中可溶性磷会随水体进入环境中，造成水体富营养化，破坏生态环境[9]。

普通小球藻（Chlorella vulgaris）隶属于绿藻门、绿藻纲、绿球藻目、小球藻科、小球藻属，细胞直径2～10 μm，呈球形或椭圆形[10]，内含丰富活性代谢产物、脂质、微量元素和蛋白质等天然物质，对外部环境条件适应性较强[11]，具有保健和药理方面的作用[12]，主要以氮磷营养盐为营养物质，可以利用其进行污水净化，改善环境[13]。

近年来利用普通小球藻处理养殖尾水，实施水体生物修复，成为养殖尾水处理技术的重点之一[14]。2017 年，SHEN 等[15]研究表明小球藻有利于含盐废水中氮磷营养盐去除，并有助于小球藻油脂积累。本研究结果将有助于进一步加深对普通小球藻去除活性磷效果和途径的认知，为普通小球藻在水产养殖尾水处理中的科学使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源及预培养

小球藻取自天津农学院海洋渔业资源实验室，培养基为f/2 培养基（硝酸钠75 mg/L；磷酸二氢钠5 mg/L；f/2 微量元素1 mL/L；f/2 维生素0.5 mL/L）。培养基配制完成在高压灭菌锅中121 ℃灭菌20 min，将藻液与培养基1∶1 混合后放入智能高级型人工气候培养箱中进行培养，每天摇瓶2～3次，防止小球藻贴壁或者沉底，培养盐度为30，培养温度为25 ℃，光照强度为50 μmol/ （m2·s），光暗比为14 h∶10 h，相对湿度为38%，持续光照培养，试验前取适量藻液，放入高速离心机离心10 min。

1.2 指标测试分析与计算方法

1.2.1 普通小球藻比生长率计算

其中Nt为第t天小球藻藻液吸光度；N0为某一时间间隔开始时小球藻藻液吸光度；Δt为时间间隔。

1.2.2 磷浓度测量

采用磷钼蓝分光光度法测量磷浓度。

1.2.3 盐度测量

采用希玛笔式盐度计测量海水盐度。

1.2.4 pH 测量

采用PHBJ-260 便携式pH 计对藻液的pH 进行测量。

1.2.5 叶绿素荧光参数测量

采用浮游植物分类荧光仪（PHYTO-PM WALZ）对叶绿素荧光各个参数进行测定。

Fv/Fm代表光合作用的最大光能转化效率，Fv/F0代表光合作用潜在活力，ΦPSⅡ代表光合作用实际光能转化效率。其公式如下：

1.2.6 吸附动力学计算

准一级模型多用来描述物理吸附过程，其动力学方程形式为：

准二级模型主要用于描述物理和复杂的化学吸附过程，其动力学方程形式为：

式中，qe和qt分别为平衡时和t时刻下的吸附率；k1为准一级吸附速率常数；k2为准二级吸附动力学速率常数。

1.2.7 数据分析

试验数据均采用origin 2018 进行数据分析。用 SPSS 2.0 进行单因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05 为差异显著。

1.3 试验方法

1.3.1 盐度对普通小球藻生长的影响

设置不同盐度梯度（0、5、10、15、20、25、30、45），取适量藻液稀释至初始浓度为0.75×106个/mL，培养于100 mL 三角瓶中，设置两个对照组，每个平行样体积均为50 mL，确保每个锥形瓶的盐度与藻初始浓度为设定值，每天人工定时摇3次并在波长为680 nm 下测量吸光度，计算其比生长速率。

1.3.2 盐度对普通小球藻吸收磷的影响

设置不同初始磷浓度（0，5，10，15，20 mg/L），在盐度为15、30，普通小球藻初始浓度为0.75×106个/mL，吸附反应温度为25 ℃，pH 为7 的条件下进行培养，在培养过程中0、24、48、72、96 h取培养液，0.22 μm 的滤膜过滤后测磷的浓度。

1.3.3 盐度对普通小球藻叶绿素荧光参数的影响

设置不同盐度（0、15、30、45），在普通小球藻初始浓度为0.75×106个/mL，吸附反应温度为 25 ℃，pH 为7 的条件下进行培养，在培养过程中0、24、48、72 h 取培养液，0.22 μm 的滤膜过滤后测磷的浓度。

1.3.4 藻密度对普通小球藻吸收磷的影响

设定藻液初始浓度OD680＝0.05、0.10、0.15（0.375×106个/mL、0.750×106个/mL、1.125×106个/mL），在磷浓度为5、20mg/L，吸附反应温度为25 ℃，pH 为7 的条件下进行培养，在培养过程中0、24、48、72、96 h 取培养液，0.22 μm 的滤膜过滤后测磷的浓度。

1.3.5 初始pH 对普通小球藻吸附磷的影响

设定pH 值为5、7、9，在藻液初始浓度为0.75×106个/mL，磷浓度为5、20 mg/L，吸附反应温度为25 ℃的条件下进行培养，在培养过程中0、24、48、72 h 取培养液，0.22 μm 的滤膜过滤后测磷的浓度。

1.3.6 吸附动力学分析

（1）24 h 吸附动力学分析

设定吸附反应条件为：吸附反应温度为25 ℃，藻液初始浓度为0.75×106个/mL，磷浓度为5、20 mg/L，pH 为7。在此条件下进行培养，在1、2、4、8、12、18、24 h 取培养液，0.22 μm 的滤膜过滤后测磷的浓度。

（2）1 h 吸附动力学分析

在之前相同试验条件下，在10、20、40、60 min取培养液，0.22 μm 的滤膜过滤后测磷的浓度。

2 结果与分析

2.1 普通小球藻细胞密度与吸光度曲线

本试验用血球计数板在三目显微镜下计算普通小球藻细胞数，用紫外分光光度计在680 nm 波长下测定普通小球藻藻液吸光度，将藻密度与吸光度值进行回归得线性回归方程：y＝7.502x-0.003 6，（R2＝0.999 3）[16]。

2.2 盐度对普通小球藻生长的影响

如图1 所示，无盐度组（0）和高盐度组（45）小球藻生长受到明显的抑制作用，培养四天后会出现部分小球藻死亡现象，两试验组之间差异显著（P＜0.05）。其他盐度组，小球藻生长较好，且无显著差异（P＞0.05）。经过4 d 培养15 盐度组小球藻藻液吸光度最高，可达0.884。

图1 盐度对普通小球藻生长的影响

陈贞奋等[17]研究表明小球藻（Chlorella vulgaris Beijerinck）在5～15 盐度水域生长最适，适盐能力较强，张奇等[18]研究发现小球藻（Chlorella vulgaris）具较广的适盐能力，可在0～45 盐度海水中生长。对比本试验结果，普通小球藻最适生长盐度为5～30，较高较低盐度对普通小球藻生长呈现的抑制作用大同小异。在淡水环境中，生长抑制作用更明显，说明经过一定时间培养，普通小球藻盐度适应能力变强，起到了盐度驯化的作用。盐度变化可以破坏藻细胞内外离子平衡，影响其渗透压从而影响藻细胞生长，因此试验中会出现随着盐度升高藻细胞生长受到抑制的现象。

2.3 盐度对普通小球藻吸收磷的影响

本试验基于2.2 试验结论选取培养结束时小球藻藻液吸光度最大的盐度值（15）与原培养基盐度值（30）做对照，进行磷吸附效率研究。

如图2 所示，24 h 内15 盐度组在初始磷浓度为5 mg/L 时吸收速率较其他试验组更快，且差异显著（p＜0.05），其吸附效率高达91.80%，48 h时各浓度组吸附效率均达到95%以上，此时基本达到吸附平衡。两盐度组相比，15 盐度组24 h 内对磷的吸附效率较高，48 h 后30 盐度组对磷的吸附效率较高，小球藻对磷的利用更完全。研究表明，伴随盐度升高，不仅小球藻生长会受到影响，小球藻对营养盐吸收也会受到抑制[19]。本试验结果显示，短时间内盐度为15 时普通小球藻对磷吸收更快。

图2 盐度对普通小球藻吸收磷的影响

2.4 盐度对普通小球藻叶绿素荧光参数影响

小球藻潜在活力强可反映其光合作用较强[20]。光合色素是微藻光合作用的有效色素，能较好地反映微藻生长状况和光合作用效率[21]。

由图3、图4 可知，随着时间增长，Fv/Fm、ΦPSII、Fv/F0显著升高，48 h 达到最大值后有略微下降趋势，经72 h 培养，30 盐度组Fv/Fm、Fv/F0最强，15盐度组ΦPSII最高，0 盐度组各参数在24 h 内明显提升后呈直线下降趋势，随着盐度增长叶绿素a含量呈先升后降趋势。

图3 盐度对普通小球藻叶绿素荧光参数的影响

图4 盐度对普通小球藻叶绿素荧光参数影响

小球藻生活环境会影响其生长，在受到胁迫时会发生显著变化[22]。盐度胁迫是影响植物光合作用的主要环境因子之一，目前已有许多关于盐度胁迫对植物光合作用影响的研究。在受胁迫时，植物Fv/Fm会降低，所以测量Fv/Fm成为一种简单快速胁迫监测方法，ΦPSⅡ为光合作用实际光能转化效率，可反映电子传递情况。研究发现过高过低盐度条件下，盐生杜氏藻PSII 叶绿素荧光参数均会显著降低。本试验中普通小球藻在高盐（45）条件下叶绿素荧光参数没有显著降低，相反在低盐（0）条件下，普通小球藻叶绿素荧光参数显著降低，说明普通小球藻有一定的耐盐性且不适宜在盐度较低条件下生长，这一优势为其更好的适应与调节海水水质提供了依据。叶绿素a 与小球藻光合作用密切相关，可以通过色素含量来判断小球藻生理状态[23]，朱新广等[24]研究表明，盐度胁迫会降低叶绿素含量，抑制电子传递效率以及光能转化效率，与本试验结果相符。

2.5 不同藻密度对普通小球藻吸收磷的影响

小球藻密度的多少会影响其对磷的吸附效能，密度太小，不能有效吸收水体中的磷，密度太大会造成资源浪费，为降低成本，提高利用率，并有效去除水体中多余的磷，本试验探究了藻密度对小球藻吸附效能的影响。如图5 所示，在初始磷浓度不同的情况下，培养液中磷浓度变化趋势总体是一致的，都呈下降趋势，当藻液浓度适中（OD680＝0.1），96 h 后磷吸附效率可达99.49%。

图5 初始pH 对普通小球藻吸附磷的影响

JAYAKUMA 等[25]研究显示，藻浓度到达一定值时，吸附效率不会随着藻浓度增加而增加。孙辉[26]研究显示，随着小球藻密度增加，其对镉的吸附效率不断增大，但吸附量会减少，较高密度会导致有效吸附表面积减少。

2.6 初始pH 对普通小球藻吸附磷的影响

由图6、图7 可知，pH 值对小球藻吸附效率影响不显著，对小球藻生长影响显著，表现为各pH 组磷吸附效率总体呈下降趋势，低pH 值时小球藻生长受到明显抑制作用。经过72 h 培养后，磷浓度可由20.000 mg/L 降至2.359 mg/L，pH＝7试验组小球藻密度可达到初始密度的6.07 倍。

图6 初始pH 对普通小球藻吸附磷的影响

图7 初始pH 对普通小球藻生长的影响

由表1 可以看出，不管藻液初始pH 为多少，吸附72 h 后pH 值都稳定在一个范围内，初始pH较小组，培养结束pH 值明显升高，pH 值较大组，培养结束pH 值会减小。张奇等[18]研究表明，在pH 为5.5～11.5 环境中小球藻都能生长，且在pH＝9 时生长量达到最大，与本试验结果吻合，pH 通过改变普通小球藻渗透压来改变其生长及对营养盐的吸收，在一定范围内随着pH 增加，普通小球藻生长加快，可有效提高其对磷浓度的吸附效率。研究表明，当溶液pH 呈酸性时，会导致藻细胞有机物流失，不利于其生长，与本研究结果偏碱性环境下更有利于普通小球藻生长一致。

表1 不同磷浓度下藻液吸附72 h 后pH 值变化情况

2.7 吸附动力学分析

由图8～图11 可见，磷初始浓度为5 mg/L，吸附1 h 后，吸附效率达到61%，2 h 后，吸附效率达到81%，24 h 后，吸附效率达99%，与72 h吸附效率相差不大，此阶段属于快速吸附阶段；磷初始浓度为20 mg/L 时，1 h 后吸附效率达到80%，24 h 后，吸附效率达83%，吸附效率超过80%，说明经过24 h 吸附已基本达到吸附平衡。

图8 24 h 内普通小球藻对磷吸附

图9 1 h 内普通小球藻对磷吸附

采用准一级动力学、准二级动力学模型对动力学数据进行拟合以更好地解释小球藻对磷的吸附过程。由图10 可以看出磷初始浓度为5 mg/L时，吸附1 h，R2＝0.999 82。由图11 可见磷初始浓度为20 mg/L 时，吸附1 h，R2＝0.999 99，通过计算得出小球藻对磷的吸附更适合准一级动力学模型[27-28]。

图10 普通小球藻对磷吸附动力学曲线

图11 普通小球藻对磷吸附动力学曲线

生物吸附通常可分为物理吸附和化学吸附，两者可共同作用，要想知道是物理吸附还是化学吸附，必须对其进行深入分析，通过动力学模型对试验数据进行拟合，确定其吸附类型，探讨其吸附机理。正常情况下，藻类生物吸附剂的吸附可以分为三个阶段，第一阶段为快速吸附期，这一阶段内吸附效率较快基本可以达到吸附平衡，李英敏等[29]研究小球藻对Cu2+的吸附性能及动力学结果显示，在吸附起始阶段，吸附效率较快。李英敏等[30]还研究表明，小球藻对铅吸附10 min内可以达到较大值。李悦[31]研究表明小球藻对铀的吸附过程符合拟二级动力学方程，吸附效率前5 min 可达90%左右，与本试验结果吸附起始阶段24 h 内普通小球藻对磷的吸附效率较高（超过80%）吻合。

3 结论

通过不同盐度对普通小球藻生长及磷利用率的探究，可得如下结论，高盐度（45）和低盐度（0）对普通小球藻生长均有抑制作用，5～30 盐度之间普通小球藻能较好生长，最适生长盐度为15，盐胁迫会抑制普通小球藻光合作用，降低其光能转化效率，不利于其对磷吸收；在藻密度为0.75×106个/mL，pH为7 时普通小球藻生长较好，对磷的吸附效率较高，1 h 内为快速吸附期。综上所述，普通小球藻在盐度15、pH 为7 和藻密度为0.75×106个/mL 时，生长最快，光合活性最强，且磷吸附效率最高。本试验初步探明了不同盐度下普通小球藻吸附磷的最佳条件，为利用普通小球藻处理养殖尾水提供了理论依据。