阿魏酸处理对桃果实采后病害与抗病物质代谢的影响

余 锐，赵晓春，杨英军，余义和

(河南科技大学园艺与植物保护学院 河南洛阳 471023)

桃是我国公认的特色水果之一，是典型的呼吸跃变型果实，味道香甜，富含各种维生素和矿物质，具有较高的营养价值[1]。桃成熟期7—8 月份，正值夏季高温，加上桃果实采后后熟极易变软，易受病原菌等微生物侵染而腐烂，是比较难贮藏的果品之一[2]。低温冷藏是延长桃果采后寿命和保持其品质的主要方法，但冷藏会影响桃果实的品质，造成生理失调，以及发生褐变、风味丧失等问题[3]。化学杀菌剂可以有效防治桃果实采后病害，但由于其长期使用会对环境造成污染、严重的将会导致病原菌产生抗药性等因素，进而受到越来越多的限制[4]。因此，通过优化环境条件，应用某些化学物质或生长调节剂等方法，可以延长桃果实的保质期[5]。柚皮提取物在一定程度上能保持采后桃果实的较高硬度、可溶性固形物和抗坏血酸含量，以及延缓桃果实品质的下降[6]。

活性氧是植物应对外界刺激的关键信号分子，在不良环境条件下，活性氧会在植物体内大量积累，加速植物衰老。活性氧的酶促清除系统主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）等，对于活性氧的清除起重要作用[7-9]。在采后果实贮藏过程中，果实品质与其抗氧化活性紧密相关。水果和蔬菜的抗氧化能力与总酚的含量有关，抗氧化能力已经成为果实品质的重要指标之一。在桃果实采后处理和贮藏过程中抗氧化物质会显著发生变化，因此探究安全高效且适宜桃果实采后的保鲜技术一直是近年来的研究热点。

阿魏酸广泛存在于水果和蔬菜中，是植物中最为丰富的酚酸之一，具有清除自由基、抗氧化的作用，已被多个国家批准用作食品添加剂[10]。有研究报道，阿魏酸能显著抑制病原菌活性，可以调节植物体内渗透压，保持植物代谢的稳定有序性[11]。在番茄中，阿魏酸处理对青霉病病原菌有直接抑制作用，能有效增加抗性相关物质的含量，保持果实的营养成分[12]。阿魏酸处理黑莓果实可以显著抑制细胞壁降解，延缓果实软化，从而延长其贮藏期[13]。阿魏酸还可以通过促进木质素的合成，加速细胞壁木质化，阻碍病原菌的进一步入侵[14]。但阿魏酸处理对桃果实采后的品质保持以及活性氧代谢的影响还鲜有报道。笔者旨在研究不同浓度的阿魏酸对采后大久保桃果实贮藏品质的影响，探究其生理机制，以期为采后贮藏保鲜提供理论参考（图1）。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试剂

试验材料桃果实品种为大久保，采自洛阳偃师周边的果园。树龄在6 年以上，常规田间管理。将七成熟的桃果实用纸箱包装，运到河南科技大学笔者实验室进行后续处理。所选果实的大小和颜色一致，且无损伤和病虫害。

将桃果实分别用50 毫克/升、100 毫克/升、200毫克/升阿魏酸和无菌水（对照）浸泡10 分钟，于常温25 ℃下贮藏。分别于处理后48、72、96 小时取样测定果实褐斑病病斑直径与发病率，处理后0、24、48、72、96 和120 小时取样测定各项指标。设置3个生物学处理，每个处理随机选取10 个果实。

1.2 病斑直径和发病率

发病率（%）=发病个数/接种个数×100，以病斑直径≥3.5 毫米确定为发病（图2）。

图2 大久保感染褐斑病病果

病斑（菌落）直径：利用游标卡尺十字交叉测定，然后取平均值。

1.3 生理指标

果实硬度通过质构仪进行测定。将果肉混合，研磨，过滤，取滤液测定糖酸含量。可滴定酸含量是用ZD-2 型自动电位滴定仪（上海金迈仪器有限公司，中国上海），以0.1 摩尔/升NaOH 滴定至终点pH值8.2 来测量的。使用手持便携式糖量测定仪对可溶性固形物含量进行测定。维生素C 含量采用邻菲啰啉比色法测定[15]。

1.4 总酚和总黄酮含量

总酚含量的测定：首先称取2.0 克桃果肉组织，加4 毫升预冷提取液（4 ℃预冷，1% HCl-甲醇）。在冰浴条件下，将其研磨至匀浆。在4 ℃避光下条件下，提取15 分钟，高速离心30 分钟，收集滤液待用。取上清液于280 纳米波长条件下测定其吸光度，以1%HCl-甲醇溶液作空白对照，3 次重复。

总黄酮含量的测定采用硝酸铝比色法[16]。称取0.5 克果肉组织，加入70% 乙醇50 毫升，称其质量，经超声处理30 分钟，获得样品溶液。其反应体系包括0.3 毫升甲醇提取液，0.6% 的亚硝酸钠，1.3% 的硝酸铝，0.625 摩尔/升的NaOH。在510 纳米下测定其吸光度值，对照使用甲醇代替提取液，以芦丁作为标准制作标准曲线，提取液中总黄酮含量换算为每克样品中芦丁的含量（微克/克）。

1.5 超氧化物歧化酶（SOD）活性

参考唐如雪等的方法[17]。随机取1 克果肉，用5 毫升冰冷的提取液匀浆。反应体系含有50 毫摩尔/升磷酸缓冲液（pH 7.8）、13 毫摩尔/升蛋氨酸、75皮摩尔/升硝基四氮唑（NBT）、10 皮摩尔/升乙二胺四乙酸、2 皮摩尔/升核黄素和0.1 毫升酶提取物。将反应体系在日光灯下照射20 分钟后，分别在560纳米波长条件下测定吸光度。SOD 酶活性以单位/克表示。

1.6 过氧化氢酶（CAT）活性

参考Wang 等[18]的方法并稍作修改。过氧化氢（CAT）活性测定反应体系包括：2 毫升磷酸缓冲液（50 毫摩尔/升，pH 7.0）、0.5 毫升H2O2（40 毫摩尔/升）、0.5 毫升粗酶液。反应温度设置30 ℃，以每分钟240 纳米处吸光值变化为1 个活性单位，CAT 酶活性以单位/克表示。

1.7 抗坏血酸氧化物酶（APX）活性

参考Nakano 等[19]的方法并稍作修改。标准测定混合物包括0.2 毫升粗酶液、2 毫升磷酸缓冲液（100 毫摩尔/升，pH 7.5）、0.5 毫升H2O2（0.5 毫摩尔/升）和0.8 毫升抗坏血酸（3 毫摩尔/升）。在25 ℃条件下，以每分钟吸光度变化0.01 为1 个活性单位，APX 活性以单位/克表示。

1.8 谷胱甘肽还原酶（GR）活性

参考李灿婴等[20]的方法测定并稍作修改。谷胱甘肽（GR）测定反应体系包括：3 毫升磷酸缓冲液（100 毫摩尔/升，pH 7.5），0.1 毫升氧化型谷胱甘肽（5 毫摩尔/升）和0.03 毫升NADPH（3 毫摩尔/升）以及0.2 毫升酶液，最后加入NADPH 启动酶促反应。在240 纳米处测定吸光值，以每分钟OD 值变化0.01 为1 个活性单位，GR 活性单位以单位/克表示。

1.9 数据处理

使用SPSS17.0（IBM，Inc.)进行数据分析，所有试验均设置3 次重复。实验结果通过Excel 2010 软件进行统计和整理。试验差异性用标准t检验表示。*是p＜0.05：表示两组数据之间显著性差异，**是p＜0.01：表示两组数据之间极显著差异。

2 结果与分析

2.1 不同浓度阿魏酸处理对桃果实贮藏期间褐腐病的影响

病斑直径和发病率是衡量病原菌对采后果实危害严重程度的重要指标。如图3 所示，将采后桃果实分别在0（对照）、50、100、200 毫克/升的阿魏酸溶液中浸泡10 分钟，放置在室温下统计桃果实的病斑直径和发病率。随着贮藏时间的延长，阿魏酸处理后的桃果实病斑直径显著低于对照，其中100 毫克/升的阿魏酸处理效果最好（图3-A）。如图3-B 所示，对照组和处理组采后桃果实发病率随着贮藏时间的增加而升高，并且对照组的发病率始终显著高于处理组。至贮藏96 小时，对照组与处理组发病率达到一致，果实几乎全部发病。结果表明，阿魏酸处理能够降低桃果实病害的发病率，其中100 毫克/升的阿魏酸处理效果最佳，能有效抑制病斑直径的扩展。

图3 不同浓度阿魏酸处理对采后桃病斑直径和发病率的影响

2.2 阿魏酸处理对采后桃果实贮藏品质的影响

果实硬度是衡量果实贮藏性状的重要指标之一，能直观地反映果实在贮藏过程中的软化程度。如图4-A 所示，桃果实在贮藏过程中硬度逐渐下降，与对照组相比，阿魏酸处理后显著延缓了桃果实贮藏期间硬度的变化。可滴定酸（TA）含量是评价采后果实风味的关键指标。桃果实TA 含量在贮藏期间呈下降趋势，对照组桃果实TA 含量下降速度明显高于阿魏酸处理（图4-B）。可见，阿魏酸处理能在一定程度上抑制果实TA 含量下降，有效维持采后果实品质。果实的可溶性固形物（TSS)含量和维生素C（Vc)是判定果实成熟度和果实内在品质的重要指标。在贮藏期间桃果实TSS 含量变化大体呈先上升后降低趋势，在96 小时阿魏酸处理桃果实TSS 含量显著高于对照（图4-C）。与对照相比，阿魏酸处理延缓Vc 含量降低，且72 和96 小时时Vc含量显著高于对照（图4-D）。这些结果表明，阿魏酸处理可以明显维持采后桃果实硬度，显著延缓TA、TSS 和Vc 含量的下降，有利于保持果实风味，防止果实品质下降。

图4 阿魏酸处理对桃果实采后贮藏品质的影响

2.3 阿魏酸处理对桃果实采后贮藏期间总酚含量和总黄酮含量的影响

总酚和总黄酮是植物体内直接的抗菌物质，反映植物对外界刺激的应答能力，二者的含量直接影响植物抗逆性能。如图5-A 所示，总酚含量均呈现缓慢上升的趋势，在贮藏72 和120 小时，阿魏酸处理总酚含量明显高于对照。如图5-B 所示，总黄酮含量呈现先上升后下降的趋势，随着贮藏时间延长，可以看出96 和120 小时时阿魏酸处理后的桃果实总黄酮含量要高于对照组。由此可见，在采后桃果实贮藏过程中，阿魏酸处理明显抑制总酚和总黄酮含量的下降。

图5 阿魏酸处理对桃果实采后贮藏期间总酚含量和总黄酮含量的影响

2.4 阿魏酸处理对桃果实采后贮藏期间抗氧化酶活性的影响

如图6 所示，在采后桃果实贮藏期间，与对照相比，阿魏酸处理桃果实后超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性均先升高后降低。在贮藏第48 小时，阿魏酸处理桃果实后其体内SOD、CAT 和GR 活性显著高于对照（图6-A，6-B，6-D）。随着贮藏时间的延长，采后桃果实中抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性先下降、再升高、再下降，但阿魏酸处理后72 和96 小时桃果实中APX 活性显著高于对照（图6-C）。这些结果表明，阿魏酸可以抑制采后桃果实抗氧化酶活性降低，延缓果实品质下降。

图6 阿魏酸处理对桃果实抗氧化酶活性的影响

3 讨 论

目前植物酚类物质对采后果蔬的保鲜机制受到广泛关注，一些研究已被证实作为植物酚类物质的阿魏酸处理可以有效提高并保持果蔬的品质，控制采后病害发生[21-22]。阿魏酸处理被用作番茄果实贮藏保鲜的新方法，可以显著提高采后番茄品质，并有效抑制病害发展[12]。笔者在本研究中通过不同浓度的阿魏酸浸泡处理采后大久保桃果实，发现100 毫克/升的阿魏酸处理效果最好，有效抑制病斑直径扩展，发病率显著降低。酚类化合物和黄酮类化合物具有杀菌和消除自由基等生物抗逆活性，在莽吉柿中研究发现总黄酮含量与抗菌活性呈正相关[23]。阿魏酸处理苹果果实后，酚类和黄酮类含量明显高于对照组，显著增强其抗病菌能力[14]。在本研究中，与上述研究一致，阿魏酸处理后桃果实体内的总酚和总黄酮含量大体都高于对照，在一定程度上说明阿魏酸处理可以提高果实的抑菌及抗病能力。

抗氧化酶在果实体内发挥多种作用，果实采后活性氧水平对果实衰老进程至关重要。阿魏酸处理能提高活性氧代谢酶活性以及抗氧化剂水平，降低苹果果实体内H2O2和MDA 的含量[24]。蛋氨酸处理显著提高采后桃果实内GR 活性、APX 活性和CAT活性，提高桃果实的抗病菌能力[25]。笔者在本研究中发现，阿魏酸处理采后桃果实能提高桃果实体内的SOD 和CAT 活性。果实中SOD 可以将超氧阴离子分解成H2O2，而CAT 可以专一地将H2O2分解成H2O 和O2，从而提高果实的抗病能力。笔者在本研究中发现，阿魏酸处理采后桃果实能提高桃果实体内的APX 和GR 活性，进而促进桃果实清除活性氧的积累，延缓果实衰老进程。

采后桃果实在贮藏期间有多种衡量其品质的指标，包括果实硬度、TA 和TSS 含量等。1-甲基环丙烯是一种新型乙烯抑制剂，能有效增强多种果实的抗氧化能力，延缓果实硬度下降，提高果实抗逆境能力[26]。褪黑素处理有效维持了花椰菜体内的维生素C、可溶性蛋白和可溶性固形物含量，显著提升了花椰菜采后贮藏品质[27]。笔者在本研究中发现，阿魏酸处理采后桃果实能有效维持果实硬度变化，延缓桃果实体内TA、TSS 和Vc 含量的下降，进而保持采后桃果实的品质。

4 结 论

笔者在本研究以采后大久保桃果实为试验材料，通过不同浓度的阿魏酸处理果实，发现能有效抑制褐斑病病斑直径的扩展，降低褐斑病病菌的发病率，其中100 毫克/升的阿魏酸处理效果最好。通过对阿魏酸处理后桃果实的生理指标测定，发现阿魏酸能维持采后果实硬度，延缓TA、TSS 和Vc 含量的下降，并提高果实的抗氧化酶活性。这些结果表明，阿魏酸处理可以提高桃采后果实的品质，延缓果实衰老，可以作为桃果实采后贮藏保鲜的一种新试剂。但是，阿魏酸处理诱导桃果实抗病性和提高果实抗氧化酶活性的相关机制尚待进一步研究。