微波消解—ICP-MS 法测定替考拉宁原料药中的元素杂质

覃玉梅，段光玉，吴素芬，邵伍军，杨荷友，袁红露，杨凯丽

（浙江海正药业股份有限公司，浙江 台州 318000）

替考拉宁（teicoplanin）是一种新型糖肽类抗菌药物，主要对革兰阳性需氧或厌氧球菌有较强的抗菌活性且耐药菌株少[1-2]，可用于治疗不能使用头孢菌素和青霉素类抗生素的患者，治疗各种严重耐药革兰氏阳性菌所致的感染[3-4]。现行版美国药典未收载替考拉宁原料药及制剂；欧洲药典[5]收载替考拉宁原料药，但无重金属检查项；中国药典[6]和日本药局方[7]收载替考拉宁原料药，且均有重金属检查项，中国药典要求重金属不超过20 μg/g，日本药局方要求重金属不超过5 μg/g。对于定性和定量分析，重金属检查法灵敏度差且专属性不足。ICP-MS 法分析速度快，专属性强，灵敏度和准确度高[8-10]。本试验采用微波消解—ICP-MS 法检测替考拉宁中10 种元素杂质，可为替考拉宁的质量控制提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

美国PE NexION2000 电感耦合等离子体质谱仪；奥地利Anton Paar Multiwave PRO超高压微波消解仪；瑞士梅特勒XPE205 电子天平；德国Merck Millipore超纯水仪。UP 级硝酸（纯度68%～ 70%，苏州晶瑞）；单元素标准溶液Li、V、Co、Ni、Cu、Cd、Hg、As、Sb、Pb、Y、Ge、In、Bi、Au（1 000 μg/mL，CRM，美国SPEX）；调谐液为Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb、U 混合标准溶液（1 μg/L，美国PE）；替考拉宁（海正药业）。

1.2 仪器条件

载气（高纯氩气）、辅助气、离子体的流量分别为1.04 L/min、1.20 L/min、15.00 L/min，射频功率1 600 W。检测模式定量分析，检测器模式双检测器，数据采集方式跳峰，校正模式线性过零点。Rpa（抗干扰参数a）均为0（65Cu 为0.011），Rpq（抗干扰参数q）均为0.25，池气体流量均为3.00 mL/ min。样品重复测定次数3，扫描次数20，KED 模式。7Li、51V、59Co 以89Y 为内标，60Ni、65Cu、75As 以74Ge为内标，111Cd、121Sb 以115In 为内标，202Hg、208Pb以209Bi 为内标。微波消解：由室温升至120 ℃用时10 min（维持10 min）；10 min 内升至160 ℃（维持10 min），10 min 内升至180 ℃（维持10 min）；功率1 500 W，Internel Temperature Limit 设置185 ℃，Temperature Control Mode 选择Average。

1.3 标准及供试品溶液配制

标准溶液：移取各单元素标准溶液Li、V、Co、Ni、Cu、Cd、Hg、As、Sb、Pb 适量，用5%硝酸稀释得Li、V、Co、Ni、Cu、Cd、Hg、As、Sb、Pb 浓度 为50、2、1、4、60、0.4、0.6、3、18、1 μg/ mL的混合储备液。将Au 单元素标准溶液用5%硝酸稀释得100 μg/mL Au 标准溶液。移取混合储备液0.06、0.1、0.2、0.3、0.4 mL 至5 个50 mL 量瓶中，各加入100 μg/mL Au 标准溶液0.1 mL，用5%硝酸稀释至刻度，制得线性标准溶液1～ 5。用5%硝酸制得Au 200 µg/L 的线性空白。用5%硝酸稀释制得含10、20、5、10 µg/L 的Y、Ge、In、Bi 混合内标溶液。

供试品溶液：称取替考拉宁0.2 g，置消解罐中，加入100 μg/mL Au 标准溶液0.05 mL 和硝酸5 mL，置赶酸仪中60 ℃预消解1 h，再进行微波消解，冷却后置赶酸仪中60 ℃赶酸1 h，冷却后用水多次洗涤并转移稀释至25 mL。同法制样品空白。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理

替考拉宁易溶于稀酸和水，几乎不溶于乙醇（96%）。采用稀硝酸直接溶解，无法完全消解样品，基质干扰严重，故用微波消解。根据微波消解仪的称样量要求，一般取0.2 g 样品（消解后定容至25 mL），分别考察不同的微波消解程序，包括升温步骤、温度控制模式（Temperature Control Mode）的选择、预消解，各配制30%限度浓度加标溶液（平行配制3 份）检测计算加标回收率。由于汞具挥发性，微波消解样品产生的挥发性产物较多，反应较剧烈会引起爆罐，结果导致汞元素流失，因此增加预消解（60 ℃常压预消解1 h）并分步程序升温。同时，微波消解温度太高，压力过大易引起爆罐，在确保样品消解完全的前提下，选择温度控制模式为Average，最高消解温度180 ℃，内置温控（Internel Temperature Limit）185 ℃（超过此温度消解罐易变形，消解液冲出损失）。实验结果显示，各元素加标回收率结果均符合要求，优化出了最佳的样品前处理方法。

2.2 质谱干扰的消除

样品的基体效应、多原子离子及同质异位素等影响ICP-MS 准确性，样品基体的干扰会造成仪器信号漂移。为减少样品基体的干扰，采用同步进样内标，即稀释了待测溶液，内标与待测元素响应值比值可对系数进行校正，减少信号漂移。内标尽量选用质量数相近且电离能相近的元素，同时考虑样品基质的干扰，根据加标回收率及标准溶液回测情况筛选内标元素，内标筛选结果见“1.2”。

2.3 仪器条件优化

针对受干扰最大的Cu 和As，内标相同时发现STD 模式比KED 模式偏差大，其他待测元素受干扰较小，故采用KED 模式，用质谱调谐液（Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb、U 均1 μg/L）优化，要 求信号 值Be ＞2 000 cps，（CeO/Ce）≤0.025，（Ce++/Ce）≤0.03，In ＞40 000 cps，Bkgd ≤3 cps，U ＞30 000 cps，得到最佳仪器条件见“1.2”。

2.4 汞残留

汞溶液具挥发性，易吸附具记忆效应，待测溶液中加入金，形成金汞齐，降低汞的残留。

2.5 线性关系、检测限与定量限

采用在线加入内标，对线性空白、线性标准溶液进行分析，响应值取重复读数3 次的平均值，绘制标准曲线。纵坐标为待测元素响应值与内标元素响应值的比值，横坐标为浓度。同法制样品空白连续测定11 次计算其标准偏差（SD），LOD=3SD/斜率/样品浓度，LOQ=10SD/斜率/样品浓度，由表1 可知线性关系良好，方法灵敏度高。

表1 线性关系、检测限和定量限Tab.1 Linear relationship，limit of detection（LOD）and limit of quantification（LOQ）

2.6 准确度和精密度

以30%、100%、150%限度配制准确度加标溶液9 份（n=3），以100%限度配制精密度加标溶液6 份（n=6）。准确度加标回收率平均值为88.3%～ 103.7%（n=3），RSD 为0.28%～ 13.1%（n=3）；精密度加标回收率平均值为89.1%～ 103.8%（n=6），RSD 为1.1%～ 5.1%（n=6）。表明准确度和精密度良好。

2.7 专属性

检测信号的专属性由ICP-MS 检测出的元素质量数判断；由空白溶液信号值判断无干扰；由样品溶液、加标样品溶液回收率测试及标准溶液回测，判断样品基质无干扰。

2.8 样品检测

按“1.3”制备6 批替考拉宁样品溶液，结果待测元素含量均小于元素杂质控制阈值。

3 结论

作为一种新型糖肽类抗菌药物，与万古霉素相比，替考拉宁脂溶性更强，半衰期更长，体液分布性良好，不良反应轻，给药方式为静脉或肌肉注射[3]。在合成替考拉宁时，元素杂质会由设备、制药用水及生产原材料等带入。在元素杂质指导原则[ICH Q3D（R2）][11]中，元素杂质包括1 类元素砷、镉、汞、铅（药品生产中禁止使用），2A 类元素钴、镍、钒（需对其潜在来源及摄入途径进行风险评估），2B 类元素（仅有意添加时才需评价其潜在来源）和3 类元素[依给药途径进行风险评估，若注射剂的每日允许暴露量（Permitted Daily Exposure，简称PDE）低于500 μg/ day，则须进行安全性评价]，注射剂PDE 低于500 μg/day 的元素有锂、铜、锑。10种元素的注射剂PDE 为锂250 μg/ day、钒10 μg/ day、钴5 μg/ day、镍20 μg/day、铜300 μg/ day、镉2 μg/ day、汞3 μg/day、砷15 μg/day、锑90 μg/ day、铅5 μg/ day。根据Q3D（R2）选项1（Option 1）方法，元素限度（μg/g）=PDE（μg/day）/ 每日摄入药品量（g/ day），每日摄入注射剂10 g 的元素限度 锂≤25 μg/g、钒≤1 μg/g、钴≤0.5 μg/g、镍≤2 μg/ g、铜≤30 μg/g、镉≤0.2 μg/g、汞≤0.3 μg/g、砷≤1.5 μg/g、锑≤9 μg/g、铅≤0.5 μg/g。元素控制阈值=30%元素限度，替考拉宁注射剂中元素控制阈值为锂≤7.5 μg/g，钒≤0.3 μg/g，钴≤0.15 μg/ g，镍≤0.6 μg/g，铜≤9 μg/g，镉≤0.06 μg/g，汞≤0.09 μg/g，砷≤0.45 μg/g，锑≤2.7 μg/g，铅≤0.15 μg/g。依美国药典[12]，ICP-MS 法需进行线性、范围、专属性、准确度、精密度及定量限验证并满足相应接受标准；若药品中总元素水平始终低于元素控制阈值，元素杂质可免检，但元素杂质评估测试要求不少于6 批连续的中试批次或不少于3 批连续的商业化批次。故本实验建立了微波消解-ICP-MS 法检测替考拉宁中10 种元素含量，并连续测试了6 批商业化批次样品，该方法简单，空白干扰小，灵敏度高，准确度和精密度良好，可用于替考拉宁原料药中元素杂质的检测。