微波法提取黑果枸杞多糖工艺条件优化

许飞利，王丹凤，刘志博

（1.商洛学院健康管理学院/陕西“四主体一联合”秦岭健康食品配料及核桃产业技术校企联合研究中心，陕西商洛 726000；2.商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西商洛 726000）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murray）是茄科，枸杞属，多棘刺灌木[1]，多分枝，枝条坚硬，常呈之字形弯曲。果实为球形，皮薄，成熟后为黑紫色，味甜多汁[2]。它属于西北干旱地区多年生的灌木野生植物，国内主要生长于青海、甘肃、宁夏、西藏、内蒙古等西北省区[3]，在国外主要分布于欧洲南部及地中海沿岸等地区[4]。黑果枸杞味甘、性平和，富含蛋白质、枸杞多糖、氨基酸、维生素、黄酮类化合物、甜菜碱，还有多种微量元素如Zn、K、Ca、Mn、Na等，以及丰富的天然水溶性的原花青素，被誉名为野生的“蓝色妖姬”[5]。黑果枸杞花青素含量超过蓝莓，是至今为止发现的花青素含量最高的天然野生植物。黑果枸杞作为经典藏药，具有极高的药用价值，常用于治疗心热、妇科病、尿道结石、皮肤病、牙龈出血等病症[6]。在民间人们喜生食、榨汁做成饮料和制成药酒使用[7]，具有多种功能，如明目降压、保护肝脏、健身补肾、美白肌肤、延年益寿等。黑果枸杞中富含枸杞多糖，总糖量可高达39.55%[8]，是黑果枸杞多种活性成分中最重要的一种物质。枸杞多糖作为一种天然活性物质，还具有绿色健康、无污染、无药性依赖等优点。它具有很多功能如抗癌抗肿瘤作用[9-10]、抗氧化和防衰老作用[11]、免疫调节作用[12]、降血糖、降血脂作用、神经保护作用[13-14]，另外，它能有效促进糖尿病患者免疫应答反应，对糖尿病患者的虚弱无力也有着一定的缓解作用[15-16]。目前枸杞多糖提取方法有水浸提取法、超声波辅助提取法、酶解提取法、微波辅助提取法等[17]。水浸提取法在生活中应用普遍，虽然操作简易，但提取率与提取纯度相对偏低。在此方法中，温度是关键影响因素，增加温度会升高枸杞多糖的提取率，但温度不宜过高，否则会使多糖水解而破坏其化学结构，所以此方法要控制好提取温度[18]。超声波辅助提取法是比较常见且工艺运行成本最低的提取多糖方法之一。与常规水提法相比，具有操作简易、提取时间短、提取温度低、提取率高、适应性广及提取物质杂质少且稳定等优点[19]。酶解提取法是广泛应用于植物多糖提取的一项生物工程技术，该方法具有条件温和、杂质易除、快速、高效的特点，但是提取成本相对较大[20]。相对而言，微波辅助提取法枸杞多糖提取率大于超声辅助提取法，考虑到试验过程节约能源，故在试验室中，微波提取法作为首选[21]。枸杞多糖因具有多种生理活性，已经成为人们研究的热点课题[22]。然而目前枸杞多糖相关产业仍存在提取效率较低、结构表征鉴定技术不全面、纯化方法不系统等制约因素[23]。为了提高黑果枸杞多糖的提取效率，本研究采用微波提取法对黑果枸杞多糖提取工艺条件进行优化，以期获得最佳提取工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料

黑果枸杞来源于青海省西宁市。

1.2 方法

1.2.1 黑果枸杞多糖的提取

称取黑果枸杞粉末2.00 g，倒入干燥的锥形瓶中，再加入适量的蒸馏水搅拌均匀。将锥形瓶放在微波炉上，功率为300 W，微波10 min后取出锥形瓶降温30 min。将黑果枸杞多糖溶液倒入离心管中，以3 000 r/min离心20 min后，将离心管中的上清液加入旋转蒸发仪，蒸发浓缩至原来的1/4，再加入2倍乙醇，4℃下乙醇提取提4 h。再将黑果枸杞多糖溶液以3 000 r/min，离心20 min。然后取沉淀用乙醇洗涤，再放入真空干燥箱，40℃条件下干燥12 h，即得黑果枸杞粗多糖[24]。

1.2.2 黑果枸杞多糖含量的测定

采用硫酸-苯酚法测定黑果枸杞中多糖的含量[25]。葡萄糖标准曲线为y=14.523x+0.030 4，R2=0.989 9，黑果枸杞多糖提取率计算公式：

式(1)中，W为黑果枸杞多糖提取率（%），m1为黑枸杞多糖测定液中含糖量（mg），V1为黑果枸杞多糖定容体积（mL），m2为黑果枸杞粉末质量（g），V2为待测样品液体的体积（mL），f（葡萄糖换算多糖转换因素）为3.17。

1.2.3 单因素试验

分别设置料液比 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g：mL），微波功率 100，300，500，700，900 W，微波时间5，10，15，20，25 min，提取次数 1，2，3，4，5 次，测定黑果枸杞多糖提取率。

1.3 正交试验设计

根据单因素试验结果，设置四因素三水平正交试验，测定黑果枸杞多糖提取率，见表1。

表1 正交试验水平因素设计

1.4 数据处理

采用Microsoft Office Excel 2016和SPSS 25.0对数据进行统计。

2 结果与分析

2.1 料液比对黑果枸杞多糖提取率的影响

如图1所示，随着料液比的增大，黑果枸杞多糖提取率呈现出近似直线形上升的趋势，当料液比为 1∶25（g：mL）时，黑果枸杞多糖提取率最大为4.27%，之后黑果枸杞多糖提取率开始下降。当料液比为 1∶10（g：mL）时，黑果枸杞多糖提取率最低为1.33%。可见黑果枸杞多糖提取率的最佳料液比为 1∶25（g：mL）。

图1 料液比对黑果枸杞多糖提取率的影响

2.2 微波功率对黑果枸杞多糖提取率的影响

如图2所示，黑果枸杞多糖提取率的微波功率在100～500 W一直呈现上升趋势，这是由于随着微波功率的增加，黑果枸杞细胞破碎得更加彻底，从而将更多的多糖从黑果枸杞原液中溶出，但当微波功率超过500 W后，黑果枸杞多糖提取率出现缓慢下降趋势，这可能是由于微波功率过高使黑果枸杞细胞中的其他溶质析出，从而导致黑果枸杞多糖提取率下降。黑果枸杞提取率最低为3.65%，此时的微波功率为100 W。黑果枸杞提取率最高为5.12%，此时的微波功率为500 W。

图2 微波功率对黑果枸杞多糖提取率的影响

2.3 微波时间对黑果枸杞多糖提取率的影响

如图3所示，当微波时间为5～20 min时，随着微波时间不断增加，黑果枸杞多糖提取率也不断提高，当微波时间为20 min时，黑果枸杞多糖提取率到达顶峰，提取率为5.83%。之后黑果枸杞多糖提取率又开始下降，这可能是因为微波时间过长导致黑果枸杞多糖的结构遭到一些破坏。因此选择20 min为最佳提取时间。

图3 微波时间对黑果枸杞多糖提取率的影响

2.4 提取次数对黑果枸杞多糖提取率的影响

如图4所示，当黑果枸杞提取次数为1～2次时，黑果枸杞多糖提取率有所提高，这是因为多次提取充分地溶解了黑果枸杞中的多糖，黑果枸杞提取2～4次时黑果枸杞多糖提取率虽然一直在上升，但是上升的幅度很小。这应该是黑果枸杞中的枸杞多糖已经被提取完全。考虑到工业化生产的需求，多次提取在生产过程中使用并不现实，这样水耗、能耗太大，成本太高。因此选择最佳提取次数为2次。

图4 提取次数对黑果枸杞多糖提取率的影响

2.5 黑果枸杞多糖提取率的正交试验

黑果枸杞多糖提取的正交试验结果见表2，黑果枸杞多糖提取的正交结果的极差分析见表3，黑果枸杞多糖提取的正交结果方差分析见表4。

表2 黑果枸杞多糖提取的正交试验结果

表3 黑果枸杞多糖提取的正交结果的极差分析

表4 黑果枸杞多糖提取的正交结果的方差分析

由表2可知，试验组中黑果枸杞多糖提取率最优组合为A2B3C1D2，即当微波功率为500 W，提取次数为 3 次，料液比为 1：20（g：mL），微波时间为20 min时，黑果枸杞多糖提取率最高为5.30%。

由表3的黑果枸杞多糖提取的正交结果的极差分析可知，微波功率（A）、微波时间（D）、料液比（C）、提取次数（B）四种因素中对黑果枸杞多糖提取率影响最大的因素是微波功率（A），对黑果枸杞多糖提取率影响最小的因素是提取次数（B），即 A＞D＞C＞B。同时可以得到，黑果枸杞多糖提取率优化工艺的最佳组合为A3B2C1D2，即最佳微波功率为700 W，提取次数为 2 次，料液比为 1：20（g：mL），微波时间为20 min。

由表4的黑果枸杞多糖提取的正交结果的方差分析可知，偏差平方和、均方及F比大小排列均为A＞D＞C＞B，偏差平方和代表试验所得数据的离散程度，均方值为偏差平方和与自由度之比，F值表示各处理之间效果的差异性，该值越大则差异越明显。自由度代表数据中可以自由变动的部分，均为2。因此，四个因素对黑果枸杞多糖提取率的影响顺序为微波功率（A）＞微波时间（D）＞料液比（C）＞提取次数（B），与黑果枸杞多糖提取率的极差分析的结果一致。

2.6 黑果枸杞多糖提取的正交结果的验证

称取黑果枸杞粉末2.00 g，倒入烧杯，加入40 mL蒸馏水，在最佳提取条件（A3B2C1D2）下提取2次，重复试验3次取平均值为测定结果（允许相对偏差为5%），验证试验结果如表 5。

由表5可知，按黑果枸杞多糖最佳提取工艺条件下进行3次平行验证试验，3次黑果枸杞多糖提取率的平均值为6.52%，高于组合A2B3C1D2的提取率5.30%，相较而言显著提高，因此在微波辅助提取工艺时这一组参数A3B2C1D2为最佳方案。

表5 黑果枸杞多糖提取的正交结果的验证

3 讨论与结论

本研究采用微波法提取黑果枸杞多糖，在单因素试验的基础上，再利用正交试验法对黑果枸杞多糖提取工艺条件进行优化。本研究发现，料液比、微波功率、微波时间对黑果枸杞多糖提取率均有较大的影响，提取次数对黑果枸杞多糖提取率的影响不大。最终获得的最佳提取条件为：料液比 1∶20（g：mL），微波功率 700 W，微波时间20 min，提取次数2次。进行3次平行验证试验，3次黑果枸杞多糖的平均提取率为6.52%，效果理想。唐静等[26]研究发现，黑枸杞多糖提取确定最佳提取工艺为料液比 1∶20（g：mL）、超声时间40 min、超声温度60℃、超声功率180 W时，黑果枸杞多糖提取率为9.19%。梅丽等[27]研究发现，果胶酶辅助提取黑枸杞多糖的最佳提取条件为料液比 1：35（g：mL）、加酶量 0.02 g、酶解时间 60 min、酶解温度30℃时，黑枸杞多糖提取率达到最大值26.60%。许英瑞等[28]研究发现，超声波提取黑枸杞多糖的最佳工艺参数为液料比41.50 mL/g，超声波功率418 W，提取时间16 min时，黑枸杞多糖的最佳条件下提取率可达（14.13±0.74）%。贾文聪等[29]研究发现，超声波提取黑果枸杞多糖的最佳条件为料液比 1∶10（g：mL）、超声时间 30 min、超声功率70 W时，黑果枸杞多糖的最佳条件下提取率为7.01%。文献[26-28]的研究结果均比本研究的黑果枸杞多糖提取率高，主要原因可能是黑果枸杞产地不同、提取的方法不同，黑果枸杞多糖提取率则有明显差异。文献[29]的研究结果与本研究的研究结果较接近。因而，合理利用黑果枸杞多糖提取方法，有助于未来黑果枸杞的开发利用，甚至能为其多糖产业化生产做出贡献，为今后植物多糖领域新思路的拓展提供理论依据与技术支持。