异常应力对MIF、COX2 和PGE2 在颞下颌关节骨关节炎中的促进作用及其机制

许颖捷，童乔莹，尚婷荷，于鹏，邵博，贾梦莹，龚忠诚*

1新疆医科大学第一附属医院(附属口腔医院)口腔颌面肿瘤外科，新疆乌鲁木齐 830054；2新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆乌鲁木齐 830054

颞下颌关节紊乱病(temporomandibular joint disease，TMD)中颞下颌关节骨关节炎(temporomandibular joint osteoarthritis， TMJOA) 多由结构紊乱病(internal derangement，ID)发展而来[1]，其病理特征包括关节软骨退化、骨赘生物形成、滑膜炎症等[2-3]。对于TMD 的治疗应遵循规范[4]，但基于现有研究，尚无有效方法阻止骨关节炎(osteoarthritis，OA)的进展[5-6]。关节慢性疼痛严重影响患者的生活质量，因此探讨疼痛机制对TMJOA的诊治与疗效具有重要意义。已有大量研究证实因素可作为独立危险因素参与TMD的发展[7-8]。口颌系统是处于咬合、神经、咀嚼肌与关节支配下的统一整体，TMJOA的发生多归因于颞下颌关节生物力学因素的变化[9]，通过三维有限元分析的研究也证实了错畸形可诱导关节结构的生物力变 化[10]。 大 鼠 单 侧 前 牙 反(unilateral anterior crossbite，UAC)咬合紊乱动物模型，在异常力学刺激下诱导颞下颌关节形成经典的OA[11-12]。本课题组前期研究发现，伴有错的TMJOA患者颞下颌关节滑液中高表达白细胞介素(IL)-1β和IL-18[13]。前列腺素E2(PGE2)作为重要的炎性因子可刺激感觉神经从而引起疼痛，在此过程中还可通过其EP2 受体(PTGER2)进行作用。PGE2 水平主要由环氧合酶2(COX2)的变化调节。PGE2、COX2 的水平增高与炎症性疼痛的病理机制密切相关。有研究表明，COX2和PGE2表达水平升高参与了机械应力引起的骨细胞早期变化[14]。巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一种多效细胞因子，可调节先天性和适应性免疫反应。有研究发现，OA滑液中MIF的含量高于正常滑液，且MIF-/-小鼠OA骨质破坏、滑膜炎症及赘生物形成情况较野生型小鼠OA模型明显减轻[15]。因此，研究关节中MIF、疼痛介质的水平可为TMJOA 的靶向治疗提供理论基础。本研究初步探讨在异常应力的刺激下，滑膜对MIF、COX2和PGE2分泌的促进在TMJOA进展中的作用及意义，旨在为TMJOA的临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂 36只6周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重120～150 g，购自新疆医科大学 动 物 实 验 中 心。IL-1β、IL-18、MIF、COX2 和PTGER2购自美国Abcam 公司，MIF、COX2和PGE2 ELISA 试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司，cDNA反转录试剂盒购自美国Thermo Fisher公司，实时定量PCR试剂盒购自德国QiaGen公司。

1.2 研究方法

1.2.1 临床研究对象 收集2020 年1 月—2021 年12月就诊于新疆医科大学第一附属医院颞下颌关节专病门诊明确诊断为TMD且需行颞下颌关节盥洗术的60 例患者的资料，并根据专科检查及辅助检查分为TMJID 组(n=30)与TMJOA 组(n=30)，TMJOA 组再根据分期将患者分为TMJOA Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期(n=10)。纳入标准：(1)TMD中诊断为ID(关节盘可复性前移位、关节盘不可复性前移位)、OA(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)的患者；(2)临床专科检查和(或)影像学辅助检查中存在个别牙错的患者。排除标准：(1)确定诊断为两种及以上的关节疾患；(2)颜面部外伤史；(3)骨骼不对称；(4)全身系统性疾病、内分泌系统疾病；(5)近期服用激素及免疫类药物；(6)妊娠期及哺乳期；(7)急性或慢性感染期。本研究已获新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准(K201910-04)，所有患者均签署知情同意书。

1.2.2 动物模型建立及分组 将SD大鼠随机分为对照组及实验组，每组18只。其中实验组采用单侧前牙反(unilateral anterior crossbite，UAC)模型[8]诱导大鼠颞下颌关节产生软骨退行性改变。选取25号的牛通乳针切割分段为2.5 mm，作为左上颌中切牙的金属“套筒”装置，选取20 号牛通乳针截取8 mm分段，其中3.5 mm 处管腔闭合向唇侧弯制形成平面导板，与剩余体部长轴呈135°，体部下端安装在左侧下颌金属“套筒”装置以形成UAC状态。将实验组分为UAC-4 周组、UAC-8 周组和UAC-12 周组(n=6)，对照组分为Ctrl-4 周组、Ctrl-8 周组和Ctrl-12 周组(为同等培养条件但无咬合干预，n=6)，并分别于4、8、12 周处死，左侧颞下颌关节软骨进行分子生物学检测，右侧颞下颌关节用作形态学检测。

1.3 视觉模拟评分(visual analogue scale，VAS) 告知患者VAS 评分刻度代表含义(0 分表示无痛不适，10分表示疼痛剧烈)，根据患者感受自身疼痛情况评估后填写咬合状态下的关节VAS数值。

1.4 颞下颌关节盥洗收集滑液及透明质酸钠注射于颞下颌关节下腔注射2%利多卡因1 ml，麻醉盥洗，冲洗出关节腔中的免疫物质，收集滑液盥洗物1 ml，以备行ELISA分析。随后同一位点注射透明质酸钠1.5 ml以润滑关节。

1.5 大鼠颞下颌关节滑液及血清收集及处理 大鼠麻醉后，取侧卧位固定大鼠头颈部，常规消毒，使用1 ml注射器抽取200 µl生理盐水后进针入关节腔，

有落空感后回抽，无血性渗出物及回抽阻力时进行关节腔盥洗。使用做好标记200 µl EP 管收集对应分组的关节滑液，在-80 ℃低温条件下归档保留，检测前3000 r/min离心20 min。随后取仰卧位固定大鼠前肢及左后肢，常规消毒后取腹部正中切口暴露腹主动脉血管鞘，使用一次性采血针及采血管收集动脉血，常温环境下静置30 min时血清血浆初步分离。将动脉血以3000 r/min 离心15 min 以分离血清及血浆。使用1.5 ml EP 管收集上层血清，注意避免吸入血浆，放入-80 ℃低温冰箱保存备用。

1.6 髁突取材及Micro-CT扫描髁突及微结构分析取耳前区切口，逐步分离组织后暴露颞下颌关节表面，打开关节囊暴露下颌骨髁突，充分游离并小心取下髁突组织，在体视显微镜下充分观察颞下颌关节髁突的关节表面和滑膜组织，然后将其置于4%多聚甲醛溶液中固定，行Micro-CT 扫描检测，分析微观结构骨的相关指标[组织体积(tissue volume，TV)、骨表面积(bone surface，BS)、骨体积(bone volume，BV)、骨表面积/骨体积(bone surface/bone volume，BS/BV)和骨体积分数(骨体积/组织体积，bone volume/tissue volume，BV/TV)]及骨小梁分析指标[骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)及骨小梁数(tabecular number，Tb.N)]，以观察骨丢失与改建情况。

1.7 ELISA 检测关节滑液或血清中MIF、COX2 和PGE2的表达情况 从室温平衡60 min后的铝箔袋中取出所需的板条，设置MIF 标准品孔、空白孔和样本孔。标准品孔各加不同浓度的MIF 标准品50 µl。样本孔中加待测样本50 µl，空白孔加样本稀释液50 µl。每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 µl，用封板膜封住反应孔，37 ℃恒温箱温育60 min。弃去液体，吸水纸上轻轻拍干，每孔加350 µl洗涤液，静置1 min后弃去洗涤液，重复5次。每孔分别加入底物A、B 液各50 µl，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50 µl，于15 min 内，在450 nm 波长处测定各孔的OD 值。采用同样的方法检测关节滑液或血清中COX2和PGE2的浓度。

1.8 大鼠源性滑膜成纤维样细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLSs)的提取及培养 于大鼠膝关节中线髌骨表面偏内侧垂直切开，逐层分离至滑膜组织，于双侧膝关节关节腔取出滑膜组织，浸泡于含10%双抗的高糖型DMEM(H-DMEM)中，冰盒低温转移入预先消毒完成的超净工作台。PBS冲洗5 min/次×3次，修剪滑膜组织达到1 mm×1 mm×1 mm 体积的块状碎片。使用等量的0.1% Ⅱ型胶原酶消化液混匀组织块沉淀，置于37 ℃恒温摇床中，180 r/min条件下消化4 h。1000 r/min 离心5 min，吸弃上层混合液后仅留底层沉淀团块。加入1 ml 完全培养基重悬组织细胞沉淀，经过200 目铜网细胞筛过滤去除残余未消化完全的组织块。将过滤后细胞悬液接种到10 cm培养皿中，在37 ℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养。培养12 h 后置于倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，2～3 d首次更换上层完全培养基，而后根据细胞生长速度及状态进行换液培养，最后得到原代FLSs。

1.9 循环流体流动剪切应力(F F S S)装置的构建FFSS 循环装置由蠕动泵、平板流动腔、细胞载片、连接管及双口烧瓶组成。FFSS 干预组分别设定为：0 dyn/cm2(静息状态)，1、3、5、10 dyn/cm2，干预1 h。取第3 代FLSs，按1×105个/ml 接种于载玻片上培养至90%贴壁率，连接流体剪切装置，随机按照以上分组进行干预。

1.10 实时定量PCR 检测IL-1β、IL-18、MIF、COX2和PGE2mRNA 的表达情况 FLSs 按照FFSS 为0，1、3、5、10 dyn/cm2进行剪切应力干预，用Trizol 裂解细胞并提取细胞内总RNA，采用核酸定量仪对各组细胞总RNA进行定量，按照反转录试剂盒说明书反转录得到cDNA。实时定量PCR引物序列见表1。反应总体系为10 µl，其中正、反义引物各0.5 µl，2×SYBR Green 5 µl，cDNA 1 µl，无酶水3 µl。β-actin为内参照基因，采用2-ΔΔCt法计算IL-1β、IL-18、MIF、COX2和PGE2mRNA相对表达水平。

1.11 Western blotting 检 测IL-1β、 IL-18、 MIF、COX2和PGE2蛋白的表达情况 将实验组分为UAC-4周组、UAC-8 周组和UAC-12 周组(n=6)，对照组分为Ctrl-4周组、Ctrl-8周组和Ctrl-12周组(为同等培养条件但无咬合干预，n=6)。大鼠分别于4、8、12 周各处死6只，用RIPA-蛋白抑制剂混合裂解液提取动物组织及细胞总蛋白，定量后行蛋白变性以维持其稳定性，-80 ℃保存。将等量的各组总蛋白电泳分离后，电转至PVDF 膜上，用一抗(IL-1β 抗体1:1000、IL-18 抗体1:1000、MIF 抗体1:1000、COX2 抗体1:500和PTGER2 抗体1:500)4 ℃孵育过夜，用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 孵育1.5 h，然后采用化学发光显色方法对PVDF膜进行曝光、显影。

1.12 统计学处理 采用SPSS 23.0 软件进行统计分析，采用GraphPad Prism 8.0 软件绘图。计数资料以例(%)表示，仅进行统计描述。计量资料以±s表示，满足正态性及方差齐性时，多组间比较采用单因素方差分析；不符合正态性及方差齐性时，多组间比较采用独立样本Mann-WhitneyU检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TMJOA 组与TMJID 组患者一般资料比较 60例患者中，女38例，男22例，女性占比明显高于男性。在TMJOA 组中，男10 例，女20 例，男女比例为1:2，年龄(37.7±8.9)岁，咬合检查可见个别牙反患者占16.7%(5/30)，个别牙锁患者占23.3%(7/30)，伴有其他错的患者18 例。在TMJID 组中，女18例，男12例，年龄(29.5±7.0)岁，咬合检查可见个别牙反患者占10.0%(3/30)，个别牙锁患者占20.0%(6/30)，伴有其他错的患者21例。专科查体发现，TMJOA组患者在咬合状态时均伴有关节疼痛，且11例伴张口受限；TMJID 组中23例患者伴有咬合状态时疼痛不适，9例伴张口受限(表2)。

表2 TMJID患者与TMJOA患者一般资料比较(n=30)Tab.2 Comparison of general data of TMJID and TMJOA patients (n=30)

2.2 TMJOA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期与TMJID 患者的VAS 评分比较 TMJOA Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者的VAS评分高于TMJID组，且在TMJOA Ⅰ期(P＜0.0001)和TMJOA Ⅱ期(P＜0.0001)时差异有统计学意义(图1)。

图1 TMJOA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者与TMJID 患者VAS 评分比较Fig.1 Comparison of VAS scores between TMJOA Ⅰ, Ⅱ, Ⅲstage patients and TMJID patients

2.3 患者颞下颌关节腔滑液MIF、PGE2和COX2的表达差异 ELISA 检测结果显示，与TMJID组比较，TMJOA组患者关节滑液MIF、PGE2和COX2表达水平明显升高(P＜0.05，图2)。此外，TMJOA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期关节滑液中MIF、PGE2 和COX2 表达水平也明显高于TMJID 组(P＜0.05，其中TMJOA Ⅱ期表达水平最高(图3)。

图2 TMJOA组与TMJID组患者关节腔滑液中MIF、COX2和PGE2的表达Fig.2 Expression of MIF, COX2 and PGE2 in synovial fluid of TMJOA and TMJID patients

图3 TMJOA不同分期组与TMJID组滑液中MIF、COX2和PGE2的表达Fig.3 Expression of MIF, COX2 and PGE2 in synovial fluid between TMJOA Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ stage patients and TMJID patients

2.4 UAC对各组大鼠颞下颌关节微观结构的影响体视显微镜下可见，对照组髁突软骨组织表面连续、平整未见明显凹陷及缺损；与对照组比较，UAC 各干预组可见软骨组织出现不同程度的凹陷变薄、充血，伴有裂隙甚至缺损，滑膜组织肿胀增厚伴有不同程度的充血。Micro-CT 扫描后可见随着干预时间的延长，髁突体积逐渐缩小，骨小梁数量减少、间隙变宽，在UAC-12周组中可见髁突软骨下骨表面凹陷缺损(图4A)。与Ctrl-4 周、Ctrl-8 周和Ctrl-12 周相应对照组比较，UAC-4 周、UAC-8 周和UAC-12 周组中的BV/TV(%)明显降低(P＜0.01)；UAC-4周、UAC-8周和UAC-12周组中BS/BV均有所增加，但仅UAC-4周与Ctrl-4组差异有统计学意义(P＜0.01)；UAC-4周、UAC-8 周和UAC-12 周组中髁突骨质的Tb.Th 有减少趋势，但仅UAC-12周组较Ctrl-12周明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01)；UAC-4周、UAC-8周组中髁突Tb.N 较对照组明显降低(P＜0.05 或P＜0.01)，但UAC-12周组并无此趋势(图4B)。

2.5 TMJOA 大鼠模型血清及颞下颌关节腔滑液MIF、COX2 和PGE2 蛋白表达情况 ELISA 检测显示，UAC-4周、UAC-8周和UAC-12周组血清中MIF、COX2 和PGE2 的表达水平均高于相应的对照组，其中仅UAC-8周组MIF、COX2与相应对照组比较差异有 统 计 学 意 义(P＜0.05)，UAC-4 周、UAC-8 周 和UAC-12 周组血清中PGE2 与相应对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。UAC-4 周、UAC-8 周和UAC-12周组关节腔滑液中的MIF、COX2 和PGE2 表达趋势与血清中基本一致，与相应对照组比较，UAC-8 周和UAC-12周组时MIF、COX2差异有统计学意义(P＜0.05)，UAC-4 周、UAC-8 周和UAC-12 周组关节滑液中PGE2 与相应对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)(图5)。

图5 各组大鼠血清及颞下颌关节腔滑液MIF、COX2和PGE2表达水平比较(n=6)Fig.5 Comparison of MIF, COX2 and PGE2 expression levels in serum and synovial fluid of temporomandibular joint in each group(n=6)

2.6 各组颞下颌关节组织中IL-1β、IL-18、MIF、COX2 和PTGER2 表 达 情 况 Western blotting 检 测 显示，与Ctrl-4周组比较，UAC-4周组IL-1β、MIF表达水平明显升高(P＜0.05)，COX2 蛋白表达水平明显降低(P＜0.05)，而IL-18 及PTGER2 蛋白表达水平差异无统计学意义(P＞0.05)；与Ctrl-8 周组比较，UAC-8周组IL-1β、IL-18、MIF、COX2及PTGER2蛋白表达水平均明显升高(P＜0.05)；与Ctrl-12 周组比较，UAC-12周组IL-1β、IL-18、MIF及PTGER2蛋白表达水平升高(P＜0.05)，而COX2蛋白表达水平差异无统计学意义(图6)。

图6 各组关节组织中IL-1β、IL-18、MIF、COX2和PTGER2表达情况(n=6)Fig.6 Expression of IL-1β, IL-18, MIF, COX2 and PTGER2 in joint tissues of each group (n=6)

2.7 FFSS 对FLSs 形态的影响 以0、1、3、5 和10 dyn/cm2FFSS 干预FLSs 后，与0 dyn/cm2组比较，随着FFSS负载增大，FLSs的形态发生明显改变，表现为细胞肿胀，细胞膜不完整甚至破裂，细胞外可见碎片；FLSs 的数量也随FFSS 负载增大而减少(图7)。

2.8 FFSS 对FLSs 中IL-1β、IL-18、MIF、COX2和PGE2mRNA表达的影响 实时定量PCR检测结果显示，与0 dyn/cm2FFSS 组比较，1 dyn/cm2FFSS 组FLSs中的PGE2、IL-18、MIFmRNA水平明显升高(P＜0.05)，而IL-1β、COX2mRNA 水平差异无统计学意义；3 dyn/cm2FFSS 组FLSs 中IL-18、MIF及PGE2mRNA 水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，而IL-1β及COX2mRNA 水平差异无统计学意义(P＞0.05)；5 dyn/cm2FFSS 组FLSs 中IL-1β、IL-18、MIF、PGE2mRNA 水平明显升高(P＜0.05)，而COX2mRNA水平差异无统计学意义(P＞0.05)；10 dyn/cm2FFSS组中FLSs 中 炎 性 因 子IL-1β、IL-18、MIF、COX2及PGE2mRNA水平均明显升高(P＜0.05)(图8)。

2.9 FFSS 对FLSs 中IL-1β、IL-18、MIF、COX2 和PTGER2 蛋白表达的影响 Western blotting 检测显示，与0 dyn/cm2组比较，各FFSS 干预组(1、3、5、10 dyn/cm2)的IL-1β、IL-18、MIF、COX2 及PTGER2蛋白表达水平均明显升高(P＜0.05)。除外3 dyn/cm2组FLSs中的MIF，以及5 dyn/cm2组FLSs中的COX2、PTGER2，随着FFSS 负载的增大，FLSs 中的IL-1β、IL-18、MIF、COX2 及PTGER2 蛋白表达水平逐渐增高(P＜0.05)(图9)。

图9 FFSS干预大鼠源性FLSs中的IL-1β、IL-18、MIF、COX2及PTGER2蛋白表达水平Fig.9 The protein expression of IL-1β, IL-18, MIF, COX2 and PTGER2 in rat FLSs under FFSS interferes

3 讨 论

促炎细胞因子释放引起的炎症被认为是OA患者疼痛的主要原因[9]。越来越多的证据表明，炎症在TMJOA 的发病机制中发挥重要作用[16-17]。滑膜炎症是较常见的早期发现的炎性疾病，通常会引起关节疼痛[18]。在OA中炎症性滑膜中活化的滑膜细胞会产生分解代谢和促炎介质，使分解软骨的蛋白水解酶过量产生，从而导致软骨基质降解。释放到滑液中的软骨分解产物被滑膜细胞吞噬，从而形成正反馈回路加剧滑膜炎症。MIF在体外可抑制巨噬细胞迁移，同时对单核细胞、中性粒细胞、T细胞和B细胞也具有趋化活性[19-20]。研究发现，MIF可调节IL-1家族蛋白(IL-1α、IL-1β 和IL-18)的表达与释放[21]，本课题组前期发现TMJOA 组患者关节滑液中高表达IL-1β 和IL-18[13]。本研究发现，与TMJID 组比较，TMJOA 组MIF、COX2和PGE2表达水平明显升高，且在TMJOA Ⅱ期患者滑液中的表达水平最高，与VAS评分趋势一致，提示MIF、COX2和PGE2表达水平与TMJOA疼痛评分呈正相关。近来有研究发现，PGE2在成骨细胞系中大量分泌[22]，并作为疼痛介质可通过感觉神经的信号传递作用反馈调节骨代谢的平衡稳态[14,22]。本研究还发现TMJOA Ⅲ期患者滑液中MIF、COX2和PGE2的表达水平较Ⅱ期患者降低，后续将继续关注MIF参与COX2-PGE2信号通路促进TMJOA发展的潜在作用机制。

近年来，多数研究将咬合作为TMD的主要危险因素，且发现第三磨牙伸长、早接触、锁[23]和反[24]可促进TMD的发生。关节在生理条件下受到各种生物力学(压缩应力、拉伸应力、FFSS等)刺激[25]。异常咬合形成过大的应力可直接影响关节组织的结构和功能。目前，UAC 诱导模型已广泛用于啮齿类动物OA的研究中，如关节盘退变[26]、咬肌萎缩[27]、软骨中异常矿物沉积[8]、软骨下骨丢失[28]、软骨细胞自噬与凋亡[29]等。本研究发现，UAC 干预形成的异常应力会导致关节髁突软骨下骨的吸收及病理性退行性变，且UAC诱导TMJOA大鼠模型的血清和关节滑液中MIF、COX2 和PGE2 表达水平升高，其中关节滑液局部的MIF水平是血清中的6～8倍，提示MIF可作为TMJOA 的生物标记物。此外，本研究还发现，UAC 形成的异常应力作用于颞下颌关节组织后可引起无菌性炎症，并促进MIF 和疼痛介质COX2 和PGE2的释放，提示异常应力可上调上述因子，并参与TMJOA的进展及疼痛。

FLSs 可分泌多种可溶性炎性介质和细胞因子，并在免疫调节中发挥重要作用[30]。颞下颌关节的生理功能与咬合因素之间的生物应力关系密切，为了模拟生物应力的刺激，本研究将FLSs暴露于不同FFSS条件下刺激以形成OA细胞模型，结果发现，FLSs暴露于FFSS后出现损伤，且IL-1β、IL-18和COX2、PGE2(PTGER2)的mRNA 和蛋白的表达水平均明显升高，促进了炎症的发生。

综上所述，本研究发现，MIF 与疼痛相关介质COX2及PGE2在伴有错畸形的TMJOA滑液中高表达，异常流体流动剪切应力下FLSs分泌MIF、COX2和PGE2参与关节微环境炎症和疼痛。但本研究仍存在一定的局限性：未在异常应力的干预下敲低MIF来观察TMJOA中疼痛介质的动态改变。因此，在异常应力的作用下，FLSs分泌MIF通过COX2-PGE2通路促进TMJOA进展的具体机制仍需进一步探讨。