后非瘟时代猪场PRRSV类NADC30感染防控案例分析

张磊　华利忠　郝飞　刘蓓蓓　孙叶茂　冯志新　邵国青

摘要：猪繁殖与呼吸综合征一直是影响养猪业最严重的疾病，通过对1个PRRSV阴性猪场母猪突发大量流产的病例进行抗体和病原检测，细菌分离鉴定和MIC测定，然后制定和实施防控措施和评价指标。结果发现：（1）50份流产母猪PRRSV抗体检测阳性率100%；（2）母猪血清、流产物、睾丸去势液及保育猪组织样本，PRRSV阳性率分别为90.0%、80.0%、100.0%及85.7%，但所有样本CSFV、PRV、PPV及SIV病原均为阴性；（3）4份PRRSV阳性样本经ORF3、ORF5及Nsp2测序和比对，结果均与NADC30同源性最高；（4）保育猪组织样本分离到链球菌和副猪嗜血杆菌，MIC测定结果显示氟苯尼考和阿莫西林对上述2种分离菌最敏感；（5）控制措施实施后的3个月，母猪的流产率从发病期的43.6%，下降至3.6%，断奶7 d内配种率从发病期的63.3%上升至87.5%，哺乳仔猪和保育猪的死亡率分别从发病期的28.4%和38.8%下降至3.8%和4.7%。通过对该病例的诊断和疫情分析，采用灭活苗免疫接种和药物保健综合防控措施可快速取得效果，为规模化种猪场的PRRSV暴发防控提供参考。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征；病原检测；最小抑菌浓度；防控；评价

中图分类号：S858.28 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）21-0182-06

自非洲猪瘟于2018年进入中国后，对中国的养猪业有着深远的影响［1-2］，尤其是在生物安全方面得到了前所未有的改善，同时也有利于猪场其他疫病的防控。然而，随着对非洲猪瘟疫病关注度不断提升，对猪繁殖与呼吸综合征（别称猪蓝耳病）的关注度逐渐下降，但并不意味着猪场猪繁殖与呼吸综合征发病率也在下降，还是有很多猪场在控制非洲猪瘟的情况下仍受蓝耳病干扰，从长远角度讲，猪场仍应该把猪繁殖与呼吸综合征作为猪场首要防控对象之一，因为猪繁殖与呼吸综合征是猪场最大的成本漏洞，也是最大的安全漏洞［3-4］。尤其是近年来，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）类NADC30毒株的传播越发严重［5］。本研究详细介绍了一PRRSV阴性猪场因突发PRRSV类NADC30毒株感染而暴发母猪流产，并造成细菌继发感染，导致仔猪死亡率增加的病例，对该病例的诊断、防控措施及评价，做了详细的阐述与分析，对临床PRRSV的防控，具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

PRV抗体检测试剂盒，购自美国IDEXX公司；PRRSV抗体检测试剂盒及猪瘟抗体检测试剂盒，购自JNT公司；PCV2抗体检测试剂盒，购自法国Synbiotics公司。

DL2000 DNA Marker、Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0 plus dye）、PrimeScriptTM One step RT-PCR Kit Ver，均为大连宝生物工程有限公司产品；TGuide S32磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司。

1.2 发病情况

江苏某猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬野毒双阴性规模化种猪场（该猪场不免疫PRRSV疫苗，PRRSV病原抗体双阴性，能繁母猪3 600头），于2020年12月始，怀孕母猪陆续出现轮转性隔顿不吃的现象，体温正常（除个别达40 ℃外），发病率30%以上。采集血液送第三方进行非洲猪瘟检测，结果为阴性。不久出现大批母猪早产、流产现象，同时，死胎和木乃伊胎数量也急剧上升。至2021年1月，保育猪陆续出现发烧（普遍39.5 ℃以上）、少食、消瘦、呼吸困难、皮肤发红、关节肿胀等临床症状，伴有少数神经症状。保育猪于发病初期使用替米考星、延胡索酸泰妙菌素等抗生素拌料用药，未达到明显效果。

1.2.1 样本采集流产胎儿及发病猪病原检测

（1）母猪样本采集：选择50头流产的母猪，采集血样、分离血清、立即冷链保存，送往实验室，进行抗体检测。同时采集流产胎儿样本5份，摘取其肺脏、脾脏、腹股沟淋巴结、脑等组织。

（2）哺乳仔猪去势液采集：早产母猪分娩的哺乳仔猪的公猪，在去势时采集睾丸去势液5份。

（3）保育猪样本采集：选择有呼吸道临床症状的保育猪7头，剖检，采集脾脏、淋巴结、肺脏、脑等组织。

所有样本采集后立即冷链保存，送往实验室，进行抗体和/或病原检测及细菌分离鉴定。

1.3 抗体检测

50份母猪血清样本，严格按照试剂盒说明书，进行PRRSV、CSFV、PRV（gE）及PCV2抗体检测。

1.4 病原检测

病原检测样本分为4种：（1）母猪血清样本：上述50份母猪血样，随机选择20份；（2）流产物：每个流产样本混合成1个流产混合物，共5份；（3）睾丸去势液5份；（4）發病保育猪的肺脏、脾脏和淋巴结混样，共7份。上述样本按照病毒基因组DNA/RNA抽提按TGuide S32磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书进行。所提取的核酸，按照试剂盒说明书，进行PRRSV、CSFV、PRV、PCV2、PPV及SIV病原检测。

1.5 PRRSV测序及比对

为明确猪场感染的PRRSV的毒株类型，选择PRRSV阳性的睾丸去势液及保育猪组织样本各2份，进行ORF3、ORF5序列及Nsp2基因序列分析，PCR产物送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，所获得的ORF3、ORF5和Nsp2基因序列和国内外报道的代表毒株用生物信息学软件DNAStar和MEGA 6.06进行同源性比对和系统进化树的构建。

1.6 细菌分离鉴定

对于采集的7份保育猪肺样，接种TSB培养基，进行细菌分离鉴定，挑选可疑菌落，单克隆后进行16S RNA的鉴定。

1.7 药敏实验

将分离鉴定获得的细菌分离株，各选择其中1个株，根据美国临床检验标准委员会（CLSI）推荐的微量稀释方法测定各种抗菌药物对分离菌的MIC测定。具体方法：将培养好的菌液采用TSA培养基调至0.5个麦氏浊度单位进行测定。细菌培养物放入37 ℃恒温培养箱培养24 h后，观察并记录结果。其中，药敏试验所使用的抗生素包括：氟苯尼考（粉剂）、替米考星（粉剂）、替米考星（包被剂1）、替米考星（包被剂2）、阿莫西林1、阿莫西林2、喹烯酮、延胡索酸泰妙菌素、复合磺胺、土霉素等10种抗生素。

1.8 综合防控措施

发病猪场采用免疫接种和药物保健综合防控措施。

（1）疫苗免疫。使用PRRSV灭活疫苗进行免疫，免疫方案为：后备母猪，经产母猪公猪全群免疫浙江美保龙生物技术有限公司的兰立定牌猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗4 mL，2周后二免2 mL；之后经产母猪和公猪每3个月免疫1次，每次2 mL；二免后3个月还没有配种的后备母猪在配种前再免疫1次，免疫剂量为2 mL。仔猪15日龄免疫1 mL，断奶后加强免疫1次，免疫剂量2 mL，具体方案详见表1。

（2）药物治疗和预防。采用20%泰万菌素 1.5 g/kg 料的剂量：添加半个月，其后3个月，每月10 d，继续使用20%泰万菌素0.8 g/kg料剂量添加进行保健。保育猪用药方案主要针对细菌感染，在断奶后采用氟苯尼考和阿莫西林进行保健，具体方案详见表1。

1.9 生产成绩统计对比分析

根据猪场的报表，以母猪和仔猪的生产成绩为参数，分别统计了发病前3月（2020年9—11月，标记为T0）、发病期间3月（2020年12月至2021年2月，标记为T1），疫情转归后期（2021年3—5月，标记为T2）3个时间段母猪的流产率，断奶7 d内配种率及仔猪的存活率，以此来评估实施的防控方案的效果。

2 结果与分析

2.1 母猪抗体检测结果

50份母猪血样，按试剂盒说明书进行抗体检测，由表2可知，PRRSV、CSFV、PCV2、PRVgE抗体阳性样本分别为50、48、42、0份，阳性率分别为100.0%、96.0%、84.0%及0.0%。从抗体检测结果可知，猪场原本PRRSV阴性母猪的PRRSV抗体全面转阳。

2.2 病原检测结果

由病原检测结果（表3）可知，母猪血清、流产物、睾丸去势液及保育猪组织样本，PRRSV阳性数分别为18、4、5、6份，阳性率分别为90.0%、80.0%、100.0%及85.7%。除此之外，睾丸去势液和保育猪组织分别检测到1份和3份PCV2阳性样本，阳性率分别为20.0%及42.9%。至于CSFV、PRV、PPV及SIV，所有样本检测结果均为阴性。

2.3 PRRSV阳性样本ORF3、ORF5及测序比对结果

将本研究选择的4株PRRSV阳性样本毒株分别命名为JS05-1-1、JS05-1-2、JS05-1-3及JS05-1-4。将所得序列与各PRRSV参考毒株相关序列进行比對分析，由表4可知，发现所得ORF3、 ORF5序列均与NADC30毒株的氨基酸序列同源性相对最高，所得Nsp2（高变区）序列相对经典毒株不连续缺失393 bp，与NADC30毒株的缺失位置、长度一致。根据构建的进化树得出所有的样品序列均与NADC30毒株在同一进化分支，由图1可知，属于类NADC30毒株。

2.4 细菌分离鉴定及药敏试验

7份肺脏样本，共分离出5株分离株，经16sRNA鉴定和比对，结果发现，其中3株为副株嗜血杆菌，2株为链球菌。选择1株链球菌和1株副猪嗜血杆菌分离菌，进行MIC测定，由表5可知，猪链球菌对氟苯尼考（≤ 60 mg/L）和其中一种阿莫西林（≤ 60 mg/L）较为敏感，副猪嗜血杆菌对氟苯尼考（≤ 60 mg/L）、替米考星粉剂（≤ 60 mg/L）、阿莫西林较为敏感（≤ 60 mg/L），对延胡索酸泰妙菌素中等敏感（≤ 250 mg/L）。

2.5 控制方案实施前后生产成绩对比分析

根据猪场的生产报表，选择母猪流产率、断奶 7 d 内配种率、产房死亡率及保育死亡率这几个参数，用于评估控制方案实施前后的效果。由统计结果（表6）可知，母猪的流产率从原来的1.3%上升至43.6%，转归后改善至3.6%；断奶7 d内配种率从原来的92.5%下降至63.3%，转归后改善至87.5%。仔猪方面，哺乳仔猪死亡率从原来的2.1%急速上升至28.4%，最后恢复到3.8%；保育猪的死亡率从原来的3.5%急速上升至38.8%，最后恢复至4.7%。

3 讨论与结论

目前，养猪从业者将非洲猪瘟的生物安全防控措施放在首位，在此背景下，猪繁殖与呼吸综合征潜入到很多猪场。因此，当下乃至今后一段时期，防控非洲猪瘟同时，仍需重视猪繁殖与呼吸综合征的防控工作。杨汉春认为非洲猪瘟防控背景下，猪繁殖与呼吸综合征在我国仍呈散发和地方性流行，猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株呈现多样性和复杂性，类NADC-30毒株广泛流行，感染猪群普遍生长不良和生产性能不佳［6］。据文献统计，2013年以来，类NADC-30毒株在我国出现后，高致病性蓝耳病检出率有所降低，但NADC30-like新毒株检出率增加，已在我国大部分省份流行。2016—2017年间，Guo等从52个临床样本中共分离到18株PRRSV，通过对ORF5和部分Nsp2基因的比较和系统发育分析 83.3%（15/18）的菌株属于PRRSV NADC30-like毒株［7-8］。本病例就是一个PRRSV阴性猪场，突然感染PRRSV类 NADC 30毒株引起的母猪广泛性流产，以及继发仔猪细菌性的混合感染，造成了巨大的损失。

在诊断方面，本病例采集了睾丸去势液进行仔猪繁殖与呼吸综合征的补充检测，睾丸去势液是指阉割2～5日龄新生仔公猪时收集的血清血渗出液［9］，该样品易于在临床条件下采集，并且可检测更多的仔猪，改进了PRRSV的监测方法［10］。使用睾丸去势液进行PRRSV病原检测的方法，自2017年首次报道后，就开始在养猪业内广泛应用。采集猪群中新生仔猪的睾丸去势液混样进行PRRSV的病原检测，并用于评估猪群中猪繁殖与呼吸综合征的动态，该可行性研究成为越来越多研究者关注的焦点［11］。本研究中使用睾丸去势液混样进行PRRSV病原检测，同时对采集的血清进行平行检测比较，初步显示去势液混样可以作为临床样品用于监测PRRSV病原的猪群，且具有有效、实用、可靠和成本低的优点。

猪繁殖与呼吸综合征的防控仍需要以严格的生物安全措施为主，辅以定期的疫病监测机制。而猪场生物安全的重点工作中，外部生物安全是猪群是否会感染的关键，内部生物安全是猪繁殖与呼吸综合征等传染病发生时紧急处置是否能成功的关键，因此猪场内部的猪流动、车辆流动、人员流动、物资进出、饲料进场、空气传播、媒介传播、饮水监测都应有相应的监管制度［12］。

在抗生素选择方案上，选择泰万菌素是因为其具有高效、广谱、不易产生耐药性、毒副作用小等优点，且具有剂量依赖性，能减少猪繁殖与呼吸综合征病毒血症或缩短病毒血症周期，减少感染猪的死亡数量和减轻病猪的临床症状［13-14］。猪链球菌、副猪嗜血杆菌是规模化猪场常见的2种细菌性疾病，由于这2种细菌耐药性的广泛存在，在治疗时需要借助实验室诊断更加科学准确地使用药物加以防控，对于猪繁殖与呼吸综合征不稳定场，其重点仍在于对猪繁殖与呼吸综合征的控制［15］。定期对猪场进行疫病检测，了解猪群健康状态，调整疫苗免疫程序和药物保健程序。

参考文献：

［1］Liu Y J，Zhang X H，Qi W B，et al. Prevention and control strategies of African swine fever and progress on pig farm repopulation in China［J］. Viruses，2021，13（12）：2552.

［2］Wang F X，Zhang H，Hou L N，et al. Advance of African swine fever virus in recent years［J］. Research in Veterinary Science，2021，136：535-539.

［3］孙泉云，朱九超. 非洲猪瘟防控背景下规模猪场猪蓝耳病感染的诊断［J］. 养猪，2021（5）：104-105.

［4］韩淑芳. 非洲猪瘟背景下猪场蓝耳病的防控［J］. 兽医导刊，2020（15）：8.

［5］Ma X，Wang P X，Zhang R T，et al. A NADC30-like PRRSV causes serious intestinal infections and tropism in piglets［J］. Veterinary Microbiology，2022，268：109397.

［6］杨汉春. 猪场蓝耳病的流行现状与防控对策［J］. 兽医导刊，2021（1）：7.

［7］Guo Z H，Chen X X，Li R，et al. The prevalent status and genetic diversity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China：a molecular epidemiological perspective［J］. Virology Journal，2018，15（1）：2.

［8］Guo Z H，Chen X X，Li X，et al. Prevalence and genetic characteristics of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in central China during 2016—2017：NADC30-like PRRSVs are predominant［J］. Microbial Pathogenesis，2019，135：103657.[HJ2mm]

［9］Trevisan G，Jablonski E，Angulo J，et al. Use of processing fluid samples for longitudinal monitoring of PRRS virus in herds undergoing virus elimination［J］. Porcine Health Management，2019，5（1）：1-5.

［10］López W A，Zimmerman J J，Gauger P C，et al. Practical aspects of PRRSV RNA detection in processing fluids collected in commercial swine farms［J］. Preventive Veterinary Medicine，2020，180：105021.

［11］López W A，Gauger P C，Harmon K M，et al. Probability of PRRS virus detection in pooled processing fluid samples［J］. Veterinary Microbiology，2021，261：109190.

［12］曲向陽. 非瘟常态下的规模化猪场健康管理体系建设的探讨［J］. 兽医导刊，2020（21）：6-7.

［13］贾义平，赵 鲁，沈俊俊，等. 猪场蓝耳病阴性转稳定型阳性的诊断处理实践［J］. 养猪，2021（5）：101-104.

［14］Tavío M M，Poveda C，Assuno P，et al. In vitro activity of tylvalosin against Spanish field strains of Mycoplasma hyopneumoniae［J］. Veterinary Record，2014，175（21）：539.

［15］何永龙，黄静琳，刘 琪，等. 规模化猪场猪链球菌病与副猪嗜血杆菌病混合感染的诊断与防治［J］. 黑龙江畜牧兽医，2016（2）：99-101，216.

收稿日期：2023-01-17

基金项目：国家重点研发计划政府间国际科技创新合作重点专项（编号：2019YFE0107300）；江苏省农业科技自主创新资金（编号：CX（22）1011）。

作者简介：张 磊（1989—），男，山西长治人，博士研究生，助理研究员，主要从事动物传染病防治研究，E-mail：zhangleisxcz@163.com；共同第一作者：华利忠（1982—），男，江苏无锡人，博士，副研究员，主要从事动物传染病防治研究，E-mail：steven828@126.com。

通信作者：邵国青，博士，研究员，主要从事动物传染病防治研究。E-mail：gqshaonj@163.com。