乙蒜素和嘧菌酯及其复配剂对4种病原真菌的室内毒力测定

李文静　任立瑞　方文生　靳茜　颜冬冬　李园　王秋霞　曹坳程

摘要：为明确乙蒜素和嘧菌酯对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、新拟盘多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）和刺盘孢属（Colletotrichum spp.）4种病原真菌的毒力效果，同时扩大乙蒜素的防治谱，筛选新的杀菌剂组合物，为枯萎病和立枯病等植物病害的防治提供更多的选择，在室内离体条件下，使用菌丝生长速率法先测定了乙蒜素和嘧菌酯对4种病原真菌的作用效果，并得到相应的毒力回归方程。结果表明，80%乙蒜素乳油对4种病原真菌的EC50分别为15.507、31.357、15.991、35.454 mg/L；250 g/L嘧菌酯悬浮剂对4种病原真菌的EC50分别为13.142、1 039.924、12.116、0.023 mg/L。随后在室内离体条件下采用 Colby法进一步评价乙蒜素和嘧菌酯对4种病原真菌的混用效果，结果表明，乙蒜素和嘧菌酯混合使用对尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、新拟盘多毛孢和刺盘孢属4种病原真菌表现出加成的作用效果。最后，对乙蒜素和嘧菌酯部分混配组合进行室内离体叶片试验，进一步验证乙蒜素和嘧菌酯的混配效果，结果表明，与单独使用乙蒜素或嘧菌酯相比，乙蒜素和嘧菌酯混合使用对病原菌的防治效果显著增加。这一试验结果表明乙蒜素和嘧菌酯复配能够扩大杀菌剂的防治谱，同时也筛选出了新的杀菌剂组合，为多种病害的科学防治提供更为有效的药剂使用参考。

关键词：乙蒜素；嘧菌酯；病原菌；Colby法；复配；增效

中图分类号：S481+.9 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）21-0113-06

乙蒜素是一種有机硫类杀菌剂，是我国在1960年研制成功的一种植物源农药新品种。它具有高效、广谱、无公害的特点，能抑制多种真菌和细菌的生长繁殖，而且它的成本和价格与其他杀菌剂相比较低。因此乙蒜素是一种极具市场潜力的杀菌剂，具有良好的发展前景。对乙蒜素的研究主要集中于病原菌的室内毒力测定及田间防效［1-4］、乙蒜素与其他药剂的复配效果和乙蒜素抑制菌株生长作用的机制等［5-10］。乙蒜素可有效抑制水稻、棉花、玉米、西瓜、黄瓜等多种作物上的病害，例如水稻稻瘟病、棉花立枯病、玉米大小斑病、西瓜蔓枯病、黄瓜苗期绵疫病等。

嘧菌酯是一种甲氧基丙烯酸酯类农药，它能够有效地抵御多种病害，包括白粉病、锈病、网斑病、霜霉病和稻瘟病等，其作用范围极其广泛，且抗病能力强［11］。

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporium）主要会引起植物的枯萎病，如黄瓜枯萎病、番茄枯萎病等；立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）容易引起作物的立枯病和根腐病，如番茄立枯病、棉花立枯病和黄瓜立枯病等；新拟盘多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）会导致植物叶斑病和根腐病，如草莓叶斑病和根腐病等；刺盘孢属（Colletotrichum spp.）会引起植物的炭疽病，如大白菜炭疽病等。

嘧菌酯对尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、新拟盘多毛孢和刺盘孢属4种病原菌的毒力均有相关报道［12-18］；乙蒜素对尖孢镰刀菌、立枯丝核菌和刺盘孢属3种病原菌的毒力均有相关报道［19-21］，而对新拟盘多毛孢的毒力目前没有相关报道。

抗药性的产生会导致药剂防效降低，因此不能长期使用某一药剂防治这些病害。鉴于此，为扩大杀菌剂的防治谱、筛选杀菌剂新组合、更有效地防治多种病害，本研究在室内离体条件下使用菌丝生长速率法测定乙蒜素和嘧菌酯及其复配剂对尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、新拟盘多毛孢和刺盘孢属4种病原菌的毒力；进一步采用Colby法评价乙蒜素和嘧菌酯对4种病原真菌的混用效果，并选择其中较好的处理组合进行离体叶片试验，目的是为了获得新型、高效、低毒的药剂组合，为病害的科学防治提供更多的药剂使用参考，并为新的复配药剂的研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试药剂

供试药剂见表1。

1.2 供试培养基及菌株

供试PDA培养基成分：马铃薯浸粉 5.0 g、葡萄糖 20.0 g、琼脂 14.0 g，pH值为5.6 ± 0.2。以1 L蒸馏水为例，称取39.0 g PDA培养基，搅拌加热至完全溶解，分装于100 mL锥形瓶中，121 °C高压灭菌15 min，备用。

供试菌株：尖孢镰刀菌采集自北京市昌平区金六环基地的黄瓜病株，病原菌的分离纯化在实验室中进行，并将其储存在PDA斜面上于4 ℃冰箱中保存备用，经鉴定，该病菌为尖孢镰刀菌；立枯丝核菌采集自北京市顺义区的番茄病株，分离纯化方法同上，经鉴定，该病菌为立枯丝核菌；新拟盘多毛孢采集自河北省保定市草莓种植基地（连续种植草莓20年以上）的草莓根腐病样本，分离纯化方法同上，经鉴定为新拟盘多毛孢［22］；刺盘孢属采集自湖南省百合病株，分离纯化方法同上，经鉴定，该病菌为刺盘孢属。所有菌株均在笔者所在实验室保存。

1.3 试验时间及地点

试验时间：2021年5—11月；所有试验均在笔者所在实验室完成。

1.4 试验方法

1.4.1 乙蒜素和嘧菌酯对4种菌株的毒力测定 使用菌丝生长速率法测定4种病原真菌对乙蒜素和嘧菌酯的敏感性。如表2所示，每种药剂设置5个浓度。本试验均在无菌环境下进行：首先，配制一系列浓度梯度的含药PDA平板；其次，从活化菌落的边缘取1个直径为5.0 mm的菌饼，菌丝面朝下，每皿接种1个菌饼，注意打孔器打在同一圆周上；再次，对照不加药剂但加等量蒸馏水，其他操作均同上，每个处理重复3次；最后，于28 ℃培养箱中倒置培养，4～7 d后测量菌落直径，并计算各药剂处理对菌丝生长的抑制率。

菌丝生长抑制率的计算公式如下：

抑制率=（对照菌落平均直径-处理菌落平均直径）/（对照菌落平均直径-菌饼直径）×100%。

1.4.2 Colby法评价药剂混用效果 根据得到的乙蒜素和嘧菌酯的毒力回归方程，2个药剂各选取2个合适的浓度（本研究以理论EC50和EC70为例），共4个药剂混配组合进行混配。操作方法同“1.4.1”节，计算不同浓度混配药剂对4种菌株的存活率和理论存活率的影响。

存活率=[1-（处理菌落直径平均值-菌饼直径）/（对照菌落直径平均值-菌饼直径）]×100%；

E0＝X1·X2·…·Xn／100（n-1）。

其中：E0为混剂的理论存活率；n为混用杀菌剂的数量；Xn为施用第n种杀菌剂后菌株的存活率。E为混剂使用后实际存活率，当E0-E＜-5%时，表明存在拮抗作用；当-5%≤E0-E≤5%时，表明存在加成作用；当E0-E＞5%时，表明存在增效作用［23-24］。

1.4.3 离体叶片法评价药剂混用效果 选择Cobly法中乙蒜素与嘧菌酯复配得到的较好的处理组合，采用离体叶片法进一步验证乙蒜素和嘧菌酯复配对立枯丝核菌的防治效果。于黄瓜叶片背面均匀喷洒配制好的药液，待药液自然风干后，将各处理叶片叶背向上，放置于培养皿中保湿，其中对照处理只含蒸馏水不含药剂，每个处理8张叶片，重复3次。将直径为5.0 mm的菌饼接种于叶片背面。接种完成后置于人工气候箱，在28 ℃、相对湿度为65%的条件下培养7 d。

防效计算公式如下：

病情指数=0×A+1×B+3×C+5×D+7×E+9×F/调查总叶片数×9×100；

防治效果=1-处理组平均病情指数/对照组平均病情指数×100%。

其中，A、B、C、D、E、F分别代表各级叶片数，详见表3。

1.5 数据处理

利用SPSS、Excel和DPS軟件处理试验数据，得到各药剂对供试菌株的EC50、毒力回归方程的斜率、卡方值和P值。使用单因素方差分析，对离体叶片的病情指数进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 4种病原菌菌株对单剂药剂的室内毒力

乙蒜素对4种菌株的室内毒力试验结果（表4）表明，80%乙蒜素乳油对尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、新拟盘多毛孢、刺盘孢属4种菌株的EC50分别为15.507、31.357、15.991、35.454 mg/L，其中对尖孢镰刀菌和新拟盘多毛孢的EC50较小，表明80%乙蒜素乳油对它们的抑制效果较好；250 g/L嘧菌酯悬浮剂对4种菌株的EC50分别为13.142、1 039.924、12.116、0.023 mg/L，其中250 g/L嘧菌酯悬浮剂对刺盘孢属的抑制效果较好，相比于其他菌株，对立枯丝核菌的EC50最大，说明250 g/L嘧菌酯悬浮剂对立枯丝核菌的抑制效果最差。

2.2 Colby法对乙蒜素和嘧菌酯混用效果的评价

2.2.1 乙蒜素和嘧菌酯混用对尖孢镰刀菌的抑制效果 在处理剂量下80%乙蒜素乳油对尖孢镰刀菌的抑制率为30%～50%，250 g/L嘧菌酯悬浮剂对尖孢镰刀菌的抑制率为40%～50%，各浓度组合对尖孢镰刀菌的抑制率在60%～75%之间。Colby法检验结果表明，当乙蒜素和嘧菌酯混用时，对尖孢镰刀菌的联合作用类型属于加成作用（图1-a）。

2.2.2 乙蒜素和嘧菌酯混用对立枯丝核菌的抑制效果 在处理剂量下80%乙蒜素乳油对立枯丝核菌的抑制率为35%～100%，250 g/L嘧菌酯悬浮剂对立枯丝核菌的抑制率为36%～60%，各浓度组合对立枯丝核菌的抑制率在57%～100%之间。Colby法检验结果表明，当乙蒜素和嘧菌酯混用时，对立枯丝核菌的联合作用类型属于加成作用（图1-b）。

2.2.3 乙蒜素和嘧菌酯混用对新拟盘多毛孢的抑制效果 在处理剂量下80%乙蒜素乳油对新拟盘多毛孢的抑制率为52%～68%，250 g/L嘧菌酯悬浮剂对新拟盘多毛孢的抑制率为45%～56%，各浓度组合对新拟盘多毛孢的抑制率在76%～98%之间。Colby法检验结果表明，当乙蒜素和嘧菌酯混用时，对新拟盘多毛孢的联合作用类型属于加成作用；其中乙蒜素浓度为40 mg/L，嘧菌酯浓度为 12.5 mg/L 时混用，对新拟盘多毛孢的抑菌效果增效明显（图1-c）。

2.2.4 乙蒜素和嘧菌酯混用对刺盘孢属的抑制效果 在处理剂量下80%乙蒜素乳油对刺盘孢属的抑制率为77%～84%，250 g/L嘧菌酯悬浮剂对刺盘孢属的抑制率为46%～80%，各浓度组合对刺盘孢属的抑制率在94%～99%之间。Colby法检验结果表明，当乙蒜素和嘧菌酯混用时，对刺盘孢属的联合作用类型属于加成作用；其中乙蒜素浓度为 32 mg/L，嘧菌酯浓度为0.04 mg/L时混用，对刺盘孢属的抑菌效果增效明显（图1-d）。

2.3 离体叶片法对乙蒜素和嘧菌酯混用效果评价

2.3.1 对尖孢镰刀菌的活性 对乙蒜素与嘧菌酯复配中得到的增效效果较好的组合进行黄瓜叶片离体试验，评价乙蒜素与嘧菌酯复配对尖孢镰刀菌的防治效果。试验结果（表5，图2-a）表明，乙蒜素与嘧菌酯复配后防治效果显著增加。单独使用浓度为5 mg/L的嘧菌酯时，防治效果为37.18%，单独使用浓度为16 mg/L的乙蒜素时，防治效果为33.33%，但两者混配使用时，防治效果可达57.69%；单独使用浓度为5 mg/L的嘧菌酯时，防治效果为37.18%，单独使用浓度为40 mg/L的乙蒜素时，防治效果为53.85%，但两者混配使用时，防治效果可达78.21%，这表明乙蒜素与嘧菌酯复配后对尖孢镰刀菌的离体防控效果显著增加。

2.3.2 对立枯丝核菌的活性 对乙蒜素与嘧菌酯复配中得到的增效效果较好的组合进行黄瓜叶片离体试验，评价乙蒜素与嘧菌酯复配对立枯丝核菌的防治效果。试验结果（表5，图2-b）表明，乙蒜素与嘧菌酯复配后防治效果显著增加。单独使用浓度为100 mg/L的嘧菌酯时，防治效果为17.50%，单独使用浓度为32.00 mg/L的乙蒜素时，防治效果为21.25%，但两者混配使用时，防治效果可达60.00%；单独使用浓度为100 mg/L的嘧菌酯时，防治效果为17.50%，单独使用浓度为 53.33 mg/L 的乙蒜素时，防治效果为72.50%，但两者混配使用时，防治效果可达83.75%，这表明乙蒜素与嘧菌酯复配后对立枯丝核菌的离体防控效果显著增加，这与室内试验结果一致。

3 结论与讨论

在实际生产中，为避免长期使用单一药剂产生抗药性，常常将多种药剂混用来延缓抗药性并提高防效［25］。研究表明，药剂混配具有一定的增效作用，同时可以降低药剂使用量和使用次数，从而降低药剂使用成本［26-27］。嘧菌酯是一种高效、广谱的杀菌剂，乙蒜素也具有高效、广谱、无公害的特点，两者作用机制不同，且无交互抗性。嘧菌酯可以与多种药剂进行复配，但目前乙蒜素与嘧菌酯复配仅在防治番茄黄叶枯萎病方面有过报道，可参考性不足［28］。

本研究测定了乙蒜素和嘧菌酯及其复配剂对4种病原真菌的室内毒力。单一药剂试验结果表明，80%乙蒜素乳油对尖孢镰刀菌和新拟盘多毛孢的抑制效果较好，其EC50分别为15.507、15.991 mg/L；250 g/L嘧菌酯悬浮剂对刺盘孢属的抑制作用极好，其EC50为0.023 mg/L，嘧菌酯在用量极低的情况下对刺盘孢属就可以达到极好的效果。与单剂相比，乙蒜素和嘧菌酯复配使用对4种病原真菌的抑制作用均有一定程度的增加，复配药剂的效果显然更好。离体叶片试验结果表明，与单一药剂相比，乙蒜素与嘧菌酯的混合使用显著提高了对尖孢镰刀菌和立枯丝核菌的防治效果。

本试验进行了乙蒜素与嘧菌酯单剂及其复配剂对4种病原真菌的室内毒力测定，二者对4种病原真菌均具有良好的抑制作用，且复配剂的抑菌效果优于单剂。这一试验结果表明乙蒜素与嘧菌酯复配能够扩大杀菌剂的防治谱，同时也筛选出了新的杀菌剂组合，为多种病害的科学防治提供了更为有效的药剂参考，并为开发防治相关病害复配药剂提供了重要的理论依据和科学支撑。但本试验为室内离体试验结果，田间使用效果尚不明确，有待于进一步深入研究。

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收稿日期：2023-02-04

基金项目：现代农业产业技术体系北京市创新团队项目（编号：BAIC01-2022）；河北省土传病害绿色防控技术创新中心项目（编号：2021K04）。

作者简介：李文静（1999—），女，河南濮阳人，硕士研究生，主要从事杀菌剂和土壤熏蒸剂乙蒜素的应用相关研究。E-mail：wjlxhzyl@163.com。

通信作者：曹坳程，博士，研究员，主要从事土壤消毒使用技术和外来入侵植物防控研究。E-mail：caoac@vip.sina.com。