养猪废水厌氧储存过程中的氮素转化特征

＊高启燕 赵心悦 周启发*

（1.台州海关综合技术服务中心 浙江 318001 2.浙江大学生命科学学院 浙江 310058）

引言

在过去的几十年里，养猪场已经从小型家庭农场转变为大型集中动物饲养场，以较低的成本提高生猪产量。根据世界观察研究所进行的研究，大型集中动物饲养场产量占全球猪肉产量的55%[1]，猪废水含有高浓度的氨、颗粒有机物（POM）和溶解性有机物（DOM）以及多种微生物[2-5]。养殖废水可以作为液体肥料[6]和灌溉水[7]再利用，因为它含有大量有价值的水和养分，可以促进植物更好地生长。

一般来说，污水在使用前应储存一段时间，这在一些国家有规定，例如意大利、芬兰、丹麦和中国。在含氨废水或沼渣的储存过程中，复杂的氮（N）转化，包括硝化-反硝化、氨氧化、厌氧氨氧化和部分硝化-厌氧氨氧化、氨同化和固氮[8-11]，可能会显著影响废水或消化液在施用后的水质和肥料质量。具体而言，一些氮转化（例如氨的挥发、硝化反硝化和氨氧化）会导致废水储存过程中大量的氮损失，这会污染环境并减少提供给植物的养分量[11]。然而，在污水或沼渣的长期储存过程中，仅研究了有限的氮转化[11]。因此，深入研究养殖废水储存期间包括氨同化的氮损失和氨转化，可为养猪废水作为液体肥料和灌溉水进行再利用提供重要的科学依据。本研究通过测定不同储存时间的pH、TOC、总氮（TN）、氨氮（NH4-N）、硝态氮（NO3-N）、亚硝态氮（NO2-N）、尿素含量，定量表征氮损失情况，并通过宏基因组测序结果分析氮转化机理。

1.材料与方法

(1)材料

养猪废水采自浙江省湖州市的一养猪场。废水使用前通过滤纸（中国双泉公司）过滤。该废水具有养猪废水的典型特征（如高氨氮、高TOC等）。

(2)厌氧储存试验

2020年11月至2021年4月，在封闭式2.0mm厚的聚丙烯塑料容器（工作容积25L）中进行厌氧储存试验，温度保持在25～30℃。

表1 本研究用养猪废水性质（n=3）

(3)废水性质测定

储存过程中每30天采集一次水样。每个废水样品通过0.45μm纤维素膜过滤，并收集上清液进行分析。氢离子浓度（pH）使用PHB-4 pH计（中国上海INESA公司）测量。总有机碳TOC使用总有机碳分析仪（德国JENA公司，MULTI N/C 3100）进行测量。用微量凯氏定氮法测定总氮TN，并按照Nash试剂分光光度法测定NH4-N含量（SEPA，2002[12]）。使用离子色谱法（Dionex ICS-1500离子色谱系统，加拿大SpectraLab Scientific Inc.）测定NO3-N和NO2-N[10]。可溶性有机氮SON的计算方法是总氮TN减去NH4-N、NO3-N和NO2-N。尿素含量采用双乙酰单肟试剂比色法测定。

(4)宏基因组分析

在储存第0天、60天、120天和180天从每个容器中收集50mL废水，水样通过0.45μm混合纤维素酯过滤器进行过滤，用TIANNAMP DNA试剂盒提取总DNA。根据Zhang和Lv[18]的方法进行宏基因组测序和序列处理。使用NEB Next Ultra DNA library Prep Kit for Illumina（美国马萨诸塞州新英格兰生物实验室）构建DNA片段库后，在Illuminia HiSeq X-Ten平台上测定序列。使用Trimmatic软件（v0.36）对原始读数进行质量控制。使用MEGAHIT软件（v1.0.6）组装Clean Reads，并使用MetaGeneMark软件（v3.38）预测开放阅读框（ORF）。使用BBMAP软件将每个样本的清洗数据映射到初始基因目录（Unigenes）（http://jgi.doe.gov/data-andtools/bbtools/），并计算映射基因的数量。使用Cotillard等人的公式计算基因丰度。对于单基因的分类学注释，在DIAMOND软件（https://github.com/bbuchfink/diamond/）中对公共非冗余（NR）蛋白质序列数据库进行BLAST搜索。预测基因的蛋白质序列根据《京都基因和基因组数据库》（KEGG）（2018.01版本）绘制。废水性质测定储存过程中每30天采集一次水样。每个废水样品通过0.45μm纤维素膜过滤，并收集上清液进行分析。氢离子浓度（pH）使用PHB-4 pH计（中国上海INESA公司）测量。总有机碳TOC使用总有机碳分析仪（德国JENA公司，MULTI N/C 3100）进行测量。用微量凯氏定氮法测定总氮TN，并按照Nash试剂分光光度法测定NH4-N含量（SEPA，2002）。按照SEPA（2002）描述的方法，使用离子色谱法（Dionex ICS-1500离子色谱系统，加拿大SpectraLab Scientific Inc.）测定NO3-N和NO2-N。可溶性有机氮SON的计算方法是总氮TN减去NH4-N、NO3-N和NO2-N。尿素含量采用双乙酰单肟试剂比色法测定。

2.结果

(1)废水性质变化

废水pH值随着储存时间的延长而降低（0～60天），然后持续升高（图1）。养猪废水的总有机碳TOC在储存期间保持降低（图2）。废水中总氮TN和氨氮NH4-N含量（图3）显著降低，NO3-N和NO2-N含量（图3）保持非常低，且随储存时间延长几乎不变。而废水可溶性有机氮SON（图3）含量显著增加。厌氧储存180天后，原始养猪废水中总氮含量由1319.3mg/L下降到842.9mg/L，损失了36.1%。原始养猪废水中727.6mg/L的NH4-N发生了转化，而储存的养猪废水中SON增加了202.6mg/L。在四个储存时间内，溶解性有机氮呈显著负相关（R2=0.992，n=12，P＜0.001）。结果表明，养猪废水厌氧储存期间发生了从NH4-N到SON的显著的氮损失和氮转化。

图1 废水储存期间不同时段pH值，数据是三次重复的平均值。条形表示标准误差

图2 废水储存期间不同时段TOC，数据是三次重复的平均值。条形表示标准误差

图3 废水储存期间不同时段总氮、氨氮、硝态氮、亚硝态氮和可溶性有机氮含量。数据是三次重复的平均值，条形表示标准差。不同字母表示P＜0.05时的显著性

(2)氮转化和氮损失相关的功能基因

①基因谱分析

在养猪废水厌氧储存的第0天、60天、120天、180天，分别检测到245840个、672634个、433604个和248439个基因。PCA分析（图4）结果表明，基因谱在不同储存时间的养猪废水之间明显分离。支链氨基酸转运蛋白（0.20%～0.45%）、转座酶（0.13%～0.44%）和ABC转运蛋白（0.10%～0.17%）基因在整个储存时间内一直是最丰富的基因。

图4 不同贮藏时间猪废水中基因谱的主成分分析（PCA）。SWW0、SWW60、SWW120和SWW180分别代表储存第0天、60天、120天和180天的养殖废水

②不同氮转化模块的相对基因丰度

如图5所示，在不同的储存时间内，反硝化作用DNI和谷氨酸/谷氨酰胺合成酶Gln的基因丰度始终最高，异化硝酸盐还原DNR、天冬酰胺合成Aspn和厌氧氨氧化Annamox的基因丰度中等，硝酸盐同化NA、同化硝酸盐还原ANR和硝化作用NI的基因丰度非常低。特别的，在整个储存时间内，反硝化作用的基因丰度始终显著高于硝化作用。反硝化作用、谷氨酸/谷氨酰胺合成酶、异化硝酸盐还原和天冬酰胺合成的基因丰度随储存时间的延长而趋于降低。结果表明：养猪废水的反硝化和氨同化（如氨基酸和酰胺的合成）基因活性较高，而硝酸盐同化、硝化和同化硝酸盐还原基因活性较低；此外，厌氧氨氧化和异化硝酸盐还原在养猪废水中也具有活性。

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3.讨论

养猪废水厌氧储存180天后，废水中总氮和氨氮含量显著降低，而废水可溶性有机氮显著增加，试验结果表明，养猪废水储存期间发生了从氨氮到可溶性有机氮的显著的氮损失和氮转化，这可能归因于一些氮反应过程（例如硝化和反硝化作用，氨氧化，厌氧氨氧化和氨挥发）。氨为大多数细菌提供营养，并为尿素合成提供底物，因此可以被细菌转化为可溶性有机氮。此外，TOC含量明显下降，表明养猪废水储存期间养分损失严重。废水储存过程中的碳氮损失会污染环境，降低肥料质量。

氮转化基因谱显示，废水储存中的氮转化非常复杂，这与之前的研究一致[11,13-16]。值得注意的是，转座酶、ABC转运蛋白和氨基转运蛋白基因被检测为整个储存时间内最丰富的基因，这表明这些细菌最终增强了它们的序列插入和运输功能，以抵抗复杂的环境变化[17]，并在养猪废水中获得碳和氮源。同样，糖和氨基酸的ABC转运蛋白也被确定为土壤中最丰富的蛋白质[18]。富含氨的养猪废水在厌氧条件下，硝化作用、硝酸盐同化和硝酸盐同化还原的基因丰度一直较低；因此，硝化作用、硝酸盐同化和硝酸盐同化还原反应可能很弱。相比之下，反硝化和厌氧氨氧化模块中的高基因丰度表明养猪废水的反硝化和厌氧氨氧化活性较高。结果可能与Svehla等人[11]的结果一致，即硝化作用有助于减少液相厌氧的长期储存期间的氮损失。在整个养猪废水的储存过程中，反硝化作用的高基因丰度和厌氧氨氧化作用的中等基因丰度可以解释养猪废水厌氧储存过程中氮的显著损失。反硝化和厌氧氨氧化模块中的高基因丰度表明养猪废水的反硝化和厌氧氨氧化活性较高。此外，尽管硝化作用的底物比反硝化作用丰富得多，但反硝化的基因丰度是硝化作用的2.6～94.1倍，这主要归因于养猪废水的厌氧储存条件。在养猪废水的储存过程中，反硝化作用的高基因丰度和厌氧氨氧化作用的中等基因丰度可以解释养猪废水厌氧储存过程中氮的显著损失。特别的，谷氨酸/谷氨酰胺合成酶的基因丰度，包括600个谷氨酸和548个谷氨酰胺合酶基因，在整个储存时间内始终处于中等水平；而天冬酰胺合成酶的基因丰度，包括353个天冬酰胺合酶基因，在整个储存时间内始终处于中等水平，表明在养猪废水厌氧储存过程中发生了氨向氨基酸和酰胺的活跃的同化作用。由于大多数细菌物种可以吸收养猪废水中的氨，因此谷氨酸/谷氨酰胺合成酶和天冬酰胺合成酶的基因丰度相当高或适中。此外，氨基酸转运蛋白基因的高丰度和检测到的不同氨基转移酶基因，指示着氨基酸和不同的酰胺化合物可以在细胞内外产生。

4.结论

在180天的储存过程中，养猪废水TOC、TN和NH4-N含量显著降低，NO3-N和NO2-N含量保持非常低，然而，溶解性有机氮（SON）含量显著上升。存储180天后，原始养猪废水中总氮含量损失了36.1%，废水中727.6mg/L的NH4-N发生了转化，而储存的养猪废水中SON增加了202.6mg/L，这表明储存过程发生了从NH4-N到SON的氮损失和氮转化。另外，在不同的储存时间内，反硝化作用和谷氨酸/谷氨酰胺合成酶的基因丰度始终最高，异化硝酸盐还原、天冬酰胺合成和厌氧氨氧化的基因丰度中等，养猪废水中反硝化和氨同化基因（如氨基酸和酰胺的合成）活性较高表明发生了显著的氮同化作用。