外泌体miRNA在狼疮性肾炎中的作用研究进展

徐璐瑶,林栩

(1.右江民族医学院临床医学院,广西百色 533000;2.右江民族医学院附属医院肾内科,广西百色 533000)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种主要影响女性的自身免疫性疾病,其特征在于不同器官/组织中存在自身抗体、免疫复合物(ICs)和补体沉积以及相关的自身免疫性炎症,其中对自身抗原耐受性丧失导致致病性自身抗体的产生,从而导致炎症和组织损伤[1]。狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)是SLE的常见并发症,LN导致肾功能逐渐下降和肾衰竭,并且是SLE患者死亡的主要原因[2]。LN涉及多种发病机制,现有研究表明,SLE的肾外病因学是基于多种组合的遗传变异体,这些变异体损害了对核自身抗原免疫耐受的机制。因为抗核抗体的存在,这种耐受性的缺失在临床上变得可检测,这也解释了临床表现的巨大差异性。此外,当中性粒细胞死亡时,它们通常释放中性粒细胞外网,这些外网由染色质纤维、组蛋白和中性粒细胞抗菌及免疫刺激蛋白组成。这种类型的细胞死亡,称为网状细胞死亡,通常是一种宿主防御机制,以捕获和杀死微生物。在SLE患者的肾脏中也发现网状中性粒细胞促进炎症,可能导致内皮损伤,并能诱导浆细胞样树突状细胞产生干扰素(IFN)-α[3]。从凋亡的中性粒细胞释放的核酸通过病毒核酸特异性Toll样受体激活先天性和适应性免疫。因此,树突状细胞、辅助性T细胞、B细胞和浆细胞都对异常的多克隆自身免疫有作用。LN的肾内病因包括抗体与多种肾内自身抗原的结合,随着肾脏免疫病理学的进展,三级淋巴组织形成和局部抗体产生增加了肾内补体激活[4]。然而,迄今为止,对于LN的治疗仍以糖皮质激素和免疫抑制剂治疗为主,但药物减量或停药后易复发,且病情逐渐加重。因此,寻求一种新的治疗策略尤为重要。

外泌体是由细胞分泌的直径为30～100 nm的盘状囊泡,含有大量的脂质、DNA、microRNA、蛋白质及代谢物等腔内内容物,这些内容物被细胞释放到细胞外,并与其他细胞上的受体结合,诱导细胞内信号传导和受体细胞生理状态的改变,在细胞稳态和细胞间通信中起着重要的作用[5]。已有相关证据表明外泌体参与了肾脏生理和各种肾脏疾病的致病机制,广泛研究包括LN、狼疮肾小球疾病、急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)、糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD),以及肾纤维化和慢性肾脏疾病(chronic kidney disease,CKD)的进展过程[6]。这些研究进一步表明,外泌体具有丰富的信息或分子,为涉及外泌体携带的这些分子异常的特定疾病中的生物标志物的发现提供了优势,因此,外泌体潜在的临床应用可能是外泌体作为生物标志物和潜在的治疗工具。

1 外泌体及miRNA

外泌体起源于被称为MVBs的内部多泡腔室,是一种小的膜囊泡,由大多数细胞类型的多囊泡核内体分泌,囊泡内含有大量的蛋白质、脂质甚至核酸,这些分子通过胞吐作用被释放到细胞外,诱导细胞内信号传导和受体细胞生理状态的修饰[7]。外泌体在细胞间起通信作用并影响靶细胞的生物学效应的机制主要有三个方面：一是外泌体可以携带配体与不同的细胞表面受体结合;二是外泌体可以与靶细胞膜结合,然后靶细胞膜将携带“新的”表面分子;三是外泌体可以与靶细胞融合,从而在两种细胞类型之间交换膜蛋白和细胞质。外泌体的产生将增加携带相关肽-MHC复合物的树突状细胞的数量,从而放大免疫反应,在没有炎症的情况下,携带外泌体的树突状细胞的自发迁移可能有助于耐受性的诱导[8]。这种扩散的结果既取决于捕获外泌体的树突状细胞的状态(特别是来自非应激或未感染的未成熟树突状细胞或肿瘤的外泌体),也取决于外泌体所携带的分子(如来自成熟/感染/应激细胞的促炎信号或来自一些非应激肿瘤的免疫抑制信号)[9]。

microRNA(miRNA)是一种长为21～22个核苷酸的小分子、非编码RNA,通过与mRNA的相互作用在调节各种生物过程中发挥重要作用,已被证明参与细胞生长、组织分化、细胞增殖和细胞凋亡等过程[10]。miRNA可以被运输到外泌体或微囊泡中,并分泌到细胞外,包括各种生物液体,因此可以进行长程细胞间通讯[11]。miRNA微阵列分析显示,在来自SLE患者的血浆样品中检测到113个上调和94个下调的miRNA,新的证据表明[12],miRNA参与了SLE的病理生理过程,在血浆或血清中检测到的肿瘤来源的miRNA可以作为检测常见人类癌症类型以及其他已知疾病和综合征的诊断及预后的循环生物标志物。它将可能为基于细胞外miRNA的生物标志物的发现和治疗模式开辟一个新的领域。

2 外泌体miRNA在LN免疫调控中的机制

LN是肾小球免疫复合物沉积和随之而来的慢性炎症反应的结果[13]。有研究报道已在SLE患者中检测到含免疫复合物的外泌体[14]。作为新的信息穿梭媒介,外泌体介导局部自分泌或旁分泌信号到附近的细胞,以及远距离内分泌信号到远处的细胞。在LN中,外泌体可能通过运载自身抗原或补体、促进免疫复合物沉积或补体激活、刺激炎症反应,进一步引起肾组织损伤或微血栓形成而产生致病作用[1]。研究表明,外泌体增强了单核细胞和T细胞迁移、单核细胞活化和巨噬细胞吞噬活性,并且促进单核细胞对促炎细胞因子IL-8的产生,而这可以通过靶向波形蛋白(si-波形蛋白)的小干扰RNA恢复到其基础水平[15]。我们观察到活动期LN患者的非经典单核细胞计数低于无肾脏受累的患者,所有单核细胞亚群在LN患者中人CX3C趋化因子受体1(CX3CR1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达均低于无LN患者,高迁移率族蛋白 B1(HMGB1)水平升高[16]。单核细胞和巨噬细胞可以通过Toll 样受体 4(TLR4)受体识别HMGB1,从而产生促炎细胞因子[17]。这些发现为巨噬细胞通过外泌体途径参与肾脏病理中的免疫应答提供了重要意义。

miRNA通过结合3’或5’非翻译区(UTR)来破坏和阻断编码蛋白的翻译,从而对mRNA序列进行转录后调节,可能是维持免疫耐受和自身免疫平衡的因素之一[18]。研究发现,在miR-155缺陷小鼠中,活化CD4+、CD25+(Foxp3-)细胞的频率降低,CD4+T细胞表现出不太明显的Th2和Th17以及略微降低的Th1反应趋势。Pristane诱导的野生型显示与INF特征相关基因(MX1、IP10、IRF7、ISG15)的表达显著上调,T效应细胞/Treg细胞的比率增加,丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和TLR通路的激活减少,并且IL-6和TNF水平降低[19]。将miR-155模拟物转染到人肾系膜细胞(HRMCs)中,miR-155可以通过下调CXCR5-ERK信号通路在趋化因子CXC配体13(CXCL13)刺激下的表达来减少HRMCs的增殖和p-ERK及转化生长因子β1(TGF-β1)的产生,因此,这表明miR-155可以通过下调CXCR5-ERK信号通路来抑制CXCL13诱导的LN中HRMCs的增殖[20]。

MOMEN-HERAVI等人[21]成功将外源性miRNA-155 mimic和miRNA-155抑制剂引入小鼠B细胞来源的外泌体,并表明负载外泌体可以将miRNA-155模拟物和miRNA-155抑制剂分别传递给原代小鼠肝细胞及RAW 264.7巨噬细胞。B细胞来源的外泌体能有效地将miRNA-155抑制剂传递到RAW 264.7细胞中,抑制miRNA-155,并在功能上导致TNF-α蛋白水平有统计学意义的下降。据报道,外泌体miRNA-155直接靶向细胞因子信号传导抑制蛋白1(SOCS1),其表达与miRNA-155水平呈负相关[22]。将miRNA-155抑制剂成功传递到RAW 264.7细胞后,SOCS1的mRNA水平升高。实验显示,与miRNA-155负载外泌体共培养的原代小鼠肝细胞中,miRNA-155的水平增加了700倍以上[21]。该研究结果有效证明了B细胞来源的外泌体可以作为基于RNA的治疗策略的有效载体,并为使用外泌体作为具有最小细胞毒性的高效传递纳米载体提供了新的理论依据。

3 外泌体miRNA可以作为LN早期诊断的潜在生物标志物

LN的特征是自身抗体诱导的肾损害,在临床实践中,由于缺乏高特异性和敏感性的理想生物标志物,使得LN的诊断是复杂和具有挑战性的。miRNA对于调节肾脏的发育、功能和稳态是不可或缺的,并且它们很容易在许多生物液体中被检测到,因此,越来越多的研究致力于探索这些分子作为LN的理想生物标志物。对血浆中miRNA表达与LN肾功能不全患者疾病活动性之间关系的分析显示,活动期SLE肾功能不全患者4种miRNA(miR-15b、miR-93、miR-25和miR-19b)的表达均显著低于稳定期患者。miR-15b和miR-22在低eGFR [eGFR<60 mL/(min·1.73 m2)]的SLE患者中显著降低,优于肾功能较好者[eGFR>60 mL/(min·1.73 m2) ](P分别为 0.01和0.012)。基于上述分析,miR-15b可以作为合并低eGFR的LN患者的潜在疾病生物标志物[23]。LI等人[24]研究了从LN患者的尿液外泌体中分离的miRNA的表达变化,观察发现伴有新月体形成的LN具有独特的尿外泌体miRNA表达谱和复杂的调控网络,并发现尿外泌体中的miR-3135b、miR-654-5p和miR-146a-5p可用作伴有新月体的LN的新的非侵入性诊断标志物。LIU等人[25]还发现PA-S14通过激活LKB1/AMPK信号通路,抑制肾小管细胞衰老,延缓纤维生成。转录组学测序和突变分析进一步证明PA-S14是通过LKB1/AMPK介导的自噬和线粒体稳态途径治疗肾纤维化的一种潜力。研究显示,在自身免疫性肾小球肾炎患者的尿液外泌体中发现miR-26a水平升高,并与尿蛋白水平呈正相关,这与足细胞损伤密切相关,外泌体中改变的miR-26a水平可以作为这些患者足细胞损伤的生物标志物[26]。

4 外泌体miRNA在LN诊断、治疗及预后靶点中的作用

相关研究表明,miR-21通过靶向与自身免疫性疾病的发展相关的几种炎性分子如IL-12、TNF和IFN-γ来介导抗炎作用[27]。SOLÉ等人[28]观察了miR-21、miR-150和miR-29c对早期评价LN肾纤维化的预后价值,证明了由miR-21、miR-29c和miR-150组合通过SP1和Smad3/TGFβ途径增加促纤维化分子,miR-29c/miR-150/miR-21表达水平的多标记组合显示出最高的敏感性和特异性(分别为94.4%和99.8%,AUC=0.996)。研究结果还进一步显示miR-29c/miR-150/miR-21组合的存在是进展为ESRD的预测因子,其预测价值优于常规生物标志物,如肌酐和eGFR。这个生物标志物组合可以用作肾纤维化的诊断标志物和进展为ESRD的预后生物标志物,为检测早期肾纤维化提供了有效策略。外泌体miRNA和特定信号转导途径之间的联系意味着免疫抑制治疗可以针对特定的miRNA谱进行调整。TANG等[29]发现在MPA治疗后,LN患者CD4+T细胞中miR-142-3p/5p和miR-146a的表达均显著增加,与未处理的细胞相比,经MPA处理的SLE患者的CD4+T细胞在假定的miRNA-142调控区域显示H4乙酰化水平富集,而在假定的miRNA-146a调控区域显示H3乙酰化水平提升,MPA通过启动子区域的组蛋白修饰激活miR-142和miR-146a的表达,这可能部分解释了MPA治疗SLE的药理机制。这些研究表明外泌体miRNA在肾脏恢复中可能起作用,可能有助于在LN中作为新的治疗靶点并指导预后评估。

5 通过外泌体miRNA靶向药物递送系统治疗LN的可能性

外泌体体积小,能有效避免单核巨噬细胞的吞噬,自由穿越血管壁和细胞外基质,可以避免调理素和凝血因子的激活。受体介导的内吞作用是外泌体与靶组织之间信息交流的主要方式之一,它优化了外泌体的内吞过程,促进了被包裹药物的内化,有利于内容物在血液中以高转运效率持续稳定地转运[30]。此外,外泌体具有很强穿透生物屏障(如血脑屏障)的能力,因此它们具有天然药物递送的优势,是很有前途的靶向药物载体。HANEY等[31]发现在PD的体内和体外模型中,外泌体运载的过氧化氢酶(CAT)可以有效地降低氧化应激并增加神经元的存活率。同时,将CAT负载于外泌体上,可以保持其生物活性,降低免疫原性,延长血液循环时间,解决其易失活、快速降解的不足,从而增强治疗效果。已有研究证明,选择经典活化的M1型巨噬细胞衍生的外泌体作为载体,M1-Exos通过caspase-3介导的途径提供了增强抗肿瘤活性的促炎环境,能降低PTX的毒性,提高其生物利用度。PTX不仅被成功地递送到小鼠的肿瘤组织,而且通过激活NF-κB通路,它建立了促炎环境以增强PTX的治疗效果[32]。上述研究揭示了外泌体作为药物载体递送的治疗剂之一,可在癌症、炎症等多种病理过程中发挥作用,将作为治疗LN的潜在治疗工具。

6 展望

当前研究结果表明,外泌体miRNA可以作为新的生物标志物和潜在的治疗工具,在LN和SLE的诊断、治疗及预后评估的过程中发挥重要作用。此外,因外泌体miRNA来源于体内,具有更好的生物相容性和更低的免疫原性、小细胞毒性及易跨膜转运等优势,其作为药物载体应用于临床治疗具有广阔的前景。然而,关于LN中miRNA的研究大多集中在血清和外周血单个核细胞,对外泌体miRNA的研究仍处于初步探索阶段,因此,未来的研究仍将致力于外泌体miRNA在自身免疫疾病中涉及的具体作用机制及相关信号通路,这将为LN的治疗模式开创新的可能性的领域。