核酸适配体荧光探针法和液基夹层杯法检测结核分枝杆菌临床应用价值比较

徐镠粤 廖庆华 彭柯皓 余美玲 陈燕梅 卓文基 赖晓宇

（广东省结核病控制中心，广东 广州 610630）

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的慢性传染病，严重危害公共健康，患者除头发、指甲外，全身各个器官和系统均可受累，以肺部感染为主。据《全球结核病报告》[1]显示，2020年全球新发结核病病例987万例，较往年有所缓解；我国作为结核病高负担国家之一，仅次于印度，发病例数居全球第二位（8.5%），原因主要是新型结核病诊断技术的开发与应用进度缓慢，新型抗结核药物匮乏。目前，结核病的微生物学诊断方法有抗酸染色镜检、MTB分离培养和体外药物敏感性试验等，其中抗酸染色镜检是我国基层结核病实验室诊断结核病的重要方法，也是较为经济的选择，但其影响因素较多，敏感性较差，部分感染患者不能被及时发现。因此，开发快速、准确、简便、低成本的结核病实验室诊断方法非常重要。

核酸适配体是一段寡核苷酸序列（DNA或RNA），是从1个体外合成的随机寡核苷酸文库中，通过指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）筛选到的与靶物质特异性结合的一簇小分子单链DNA或RNA片段[2]。适配体具有可体外人工合成、高特异性、高亲和力、高敏感性，以及作用的靶分子范围极广等特点[3]。本研究中的核酸适配体荧光探针法是广东省结核病控制中心和有关企业共同研发的一种新的MTB镜检方法，目前尚处于实验阶段。液基夹层杯法与传统的抗酸染色镜检法最大的区别在于具有消化富集特点，能够有效提高检出率[4]。本研究拟评估液基夹层杯法和核酸适配体荧光探针法在临床诊断结核病中的应用价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2 0 2 1年3-5月东莞市第六人民医院175例临床确诊为肺结核的住院患者（肺结核组），其中男1 0 3 例、女7 2 例，年龄（43.6±10.3）岁。另选取80名健康体检者为对照组，其中男46名、女34名，年龄（40.8±9.6）岁。留取所有研究对象3份痰液样本（清晨痰、即时痰和夜间痰，均为用药前留取），将3份痰液样本混匀后，分别用液体培养法、固体培养法、抗酸染色镜检法、液基夹层杯法和核酸适配体荧光探针法进行检测。肺结核诊断符合《肺结核诊断标准（WS288-2017）》要求[5]。排除标准：1）长期接受糖皮质激素或免疫抑制剂治疗；2）伴心脏、肝脏、肾脏疾病；3）恶性肿瘤患者。本研究经广东省结核病控制中心伦理委员会批准（20211129），所有受试者或其家属均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 液体培养法

将痰液样本用NALC-NaOH混合溶液（批号C12157777，上海麦克林生化科技有限公司）消化离心后，弃上清，用磷酸盐缓冲液（批号112520210408，上海碧云天生物技术有限公司）重悬，加入含有MGIT PANTA和MGIT生长添加剂（批号1042610，美国BD公司）的培养管中，使用BACTECTM MGIT 960液体培养系统（美国BD公司）进行培养。培养阳性结果系统直接报告；培养阴性，42 d（6周）后报告结果。

1.2.2 固体培养法

将痰液样本用4%氢氧化钠消化15 min，接种于罗氏固体培养基（批号20211122，珠海贝索生物技术有限公司），于37 ℃温箱中孵育，持续观察菌株生长情况，如56 d（8周）后培养基无菌落生长，则报告为阴性。

1.2.3 液基夹层杯法

将痰液样本用消化液（批号201201，湖南天骑医学新技术股份有限公司）充分混匀后放置30～60 min，至消化完全。取2 mL消化好的样本，加入已预热湿膜后的夹层杯中，使用痰自动涂片染色机（湖南天骑医学新技术股份有限公司）进行抗酸染色，烘干，油镜下观察。

1.2.4 核酸适配体荧光探针法

将痰液样本用4%氢氧化钠消化15 min，加入蛋白酶K溶液，酶解后离心去上清，加入核酸适配体荧光探针，磷酸盐缓冲液温和振荡孵育后离心去上清，用磷酸盐缓冲液重悬，涂片镜检。MTB镜下呈现杆状绿色荧光（图1）。

图1 核酸适配体荧光探针法阳性涂片

1.2.5 抗酸染色镜检法

将痰液样本直接涂布于载玻片上，用抗酸染色液（批号C210401，珠海贝索生物技术有限公司）进行染色，自然干燥，油镜下观察。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。采用Kappa一致性检验进行一致性分析，采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，R O C）曲线评价核酸适配体荧光探针法诊断肺结核的效能。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺结核组和对照组5种方法检测结果

对照组中，抗酸染色镜检法和核酸适配体荧光探针法分别检出1例和3例阳性，其他方法均为阴性。5种方法检测结果见表1。

表1 肺结核组和对照组5种方法检测结果 例

2.2 核酸适配体荧光探针法诊断价值

以液体培养法为参考标准，核酸适配体荧光探针法的敏感性为54.79%、特异性为50.98%、准确度为52.57%、阳性预测值为44.44%、阴性预测值为61.68%。一致性分析结果显示，核酸适配体荧光探针法与液体培养法、抗酸染色镜检法一致性较差（P＞0.05）；见表2、表3。ROC曲线分析结果显示，以液体培养法为参考，核酸适配体荧光探针法诊断肺结核的曲线下面积为0.529，95%可信区间为0.442～0.616，P=0.515；以抗酸染色镜检法为参考，核酸适配体荧光探针法诊断肺结核的曲线下面积为0.506，95%可信区间为0.420～0.591，P=0.899。

表2 核酸适配体荧光探针法与液体培养法比较 例

表3 核酸适配体荧光探针法与抗酸染色镜检法比较例

2.3 液基夹层杯法诊断价值

以液体培养法结果为参考，液基夹层杯法的敏感性为78.08%、特异性为98.04%、准确度为89.71%、阳性预测值为96.61%、阴性预测值为86.21%。一致性分析结果显示，液基夹层杯法与液体培养法、抗酸染色镜检法一致性较好（P＜0.001）。见表4、表5。

表4 液基夹层杯法与液体培养法比较 例

表5 液基夹层杯法与抗酸染色镜检法比较 例

ROC曲线分析结果显示，以液体培养法为参考，液基夹层杯法诊断肺结核的曲线下面积为0.881，95%可信区间为0.821～0.940，P＜0.001；以抗酸染色镜检法为参考，液基夹层杯法断肺结核的曲线下面积为0.792，95%可信区间为0.711～0.874，P＜0.001。

3 讨论

结核病是全球十大致死性疾病之一，尽管不断有新的诊断方法、药物和疫苗被开发出来，但结核病仍是威胁人类健康的全球性公共卫生问题。结核病的检测方法很多，痰涂片抗酸染色镜检简单、快速、经济，是最常用的方法，特别是在欠发达地区[6]；培养法作为公认的诊断结核病的病原学金标准，具有高敏感性和特异性，但耗时较长[7]；液基夹层杯法是国家科技重大专项成果，作为结核病诊断的新技术，具有生物安全性高和阳性检出率高的特点[4]；近年来，国内外关于适配体的研究发展迅速，已成功筛选到多种MTB适配体用于结核病的诊断和鉴别，其检测敏感性和特异性明显高于传统方法[2]。有研究发现，液体培养法和固体培养法阳性率差异无统计学意义（P＞0.05），但固体培养法操作简单，成本低，可以直接判断是否存在污染，更适合基层实验室开展；液体培养法则更为快速、准确[8]。基于此，本研究以液体培养法为参考，比较液基夹层杯法和核酸适配体荧光探针法的一致性。借鉴培养法对样本的消化预处理是液基夹层杯技术的主要创新点，结合充分震荡，使痰液样本完全液化，有利于抗酸杆菌在特殊底膜上沉淀，然后染色读片。该技术相较于传统涂片染色，阳性率有极大的提高[9]，并有效避免了生物安全风险。本研究发现，液基夹层杯法敏感性、特异性、准确度、阳性预测值和阴性预测值与已有研究结果[10]一致，各项指标优于抗酸染色镜检法，且液基夹层杯法与液体培养法一致性较好。本研究有2例液基夹层杯法阳性、液体培养法阴性的样本，可能与患者服用过抗结核药物有关。抗结核药物治疗后，患者体内MTB活性降低，排菌减少，从而可能导致结果出现涂片阳性、培养阴性[11]。

适配体是单链DNA或RNA寡核苷酸，能够与靶分子结合，具有很高的特异性和亲和力，因此，适配体被用于诊断、生物传感器和靶向治疗，被认为是酶联免疫吸附试验中抗体的替代品[12]。目前已研发出多种应用于MTB诊断的适配体，如分泌蛋白MPT64、CFP-10、ESAT6，作为靶物质的适配体，在MTB诊断上均有重大突破[2]。本研究采用了一种新型适配体技术--核酸适配体荧光探针法检测MTB，结果显示，以液体培养法为参考，核酸适配体荧光探针法敏感性为54.79%，这与成熟的液基夹层杯法和培养法的结果有较大差异；在阴性对照组中，有3例被判断为阳性；经Kappa一致性分析和ROC曲线分析，发现核酸适配体荧光探针法与液体培养法、抗酸染色镜检法的一致性均较差。有研究发现，在筛选核酸适配体的过程中，一些适配体的结合可能会因竞争相同的结合位点而被其他抗体抑制；另外，空间位阻和核苷酸长度等也会影响适配体的亲和力，这可能是该方法诊断价值不高的原因之一[13]。基于核酸适配体的优化，可以通过位点序列的优化或从动力学上改善核酸适配体，从而提高其诊断MTB感染的价值[14]。

本研究样本量较少，结论具有一定局限性，需要进一步研究结果加以验证。

综上所述，液基夹层杯法在结核病诊断中的价值较高，核酸适配体荧光探针技术尚需进一步优化。