LC-ESI-MS/MS测定白酒中氨基甲酸乙酯的方法研究

董孝元，周 玉，余 义，刘 莎，汪明迪，孙 莉，唐艳荣*

（1.黄鹤楼酒业有限公司，湖北 武汉 430050；2.湖北信嘉检测科技有限公司，湖北咸宁 437000；3.黄鹤楼酒业（咸宁）有限公司，湖北咸宁 437000）

中国是蒸馏酒生产大国。酒类在发酵蒸馏过程中会产生一种致癌物质氨基甲酸乙酯，该物质不断为大众所熟知，是食物在发酵或贮存过程中天然产生的物质，普遍存在于发酵食品和酒类产品中。众所周知，用粮食酿造的白酒需要经过发酵以及高温蒸煮，酿造酒中的氨基甲酸乙酯主要是由乙醇和尿素共同作用产生的。尿素是在发酵过程中酵母分解精氨酸所产生的副产品。氨基甲酸乙酯也会在蒸馏酒内产生，特别是核果（如樱桃、杏和梅）烈酒。果核所含的氰基糖苷在酶水解后会产生一种名为异氰酸酯的副产品，异氰酸酯与酒中的乙醇发生化学反应产生氨基甲酸乙酯。

氨基甲酸乙酯是一种广泛存在于白酒饮料中的2A 类致癌物质，对人体健康存在潜在危害性[1]，各类酒中均不同程度微量存在，一些国家对酒中的含量有明确的限制规定[4]。关于食物中的EC含量，国际上对食品及酒类的氨基甲酸乙酯含量控制规定各不相同。我国白酒固态发酵方式及独特的生产工艺，在一定程度上限制了现有氨基甲酸乙酯控制措施的可使用性。目前氨基甲酸乙酯的检测方法包括液相法、液相质谱串联法、气相质谱串联法等[3]。本文从利用液相质谱联用仪高效快速检测氨基甲酸乙酯入手，优化前处理方式，缩短检测出峰时间，有利于我国白酒中氨基甲酸乙酯限量标准的建立，为消费者和白酒生产企业提供参考，使我国白酒企业得以良性发展及保障白酒产品的质量安全[2]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品：市售白酒。

试剂及耗材：氨基甲酸乙酯（规格0.1 g，储存温度20 ℃±4 ℃），Dr.Ehrenstorfer GmbH；乙腈（色谱纯），美国Baker 公司；甲酸（色谱纯），麦克林集团有限公司；超纯水，德国默克密理博MiLLi-QDireat。

仪器设备：Agilent 1260LC-Agilent 6460 安捷伦三重串联四级杆质谱仪；Agilent ZORBAX RXC18安捷伦色谱柱（2.1×150 mm，1.8 μm）；有机滤膜(孔径0.22 μm)，天津津腾；天津津腾全玻璃微孔过滤器(规格1000 mL)。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

标准储备液（100 mg/L）：准确称取10 mg（精确至0.0001 mg）氨基甲酸乙酯标准品于100 mL 容量瓶中，用一级水溶解并定容至100 mL，配制成100 mg/L的标准储备液，置于4 ℃冰箱中保存。

标准工作液：分别准确吸取0.04 mL、0.08 mL、0.16 mL、0.40 mL、0.80 mL 标准储备液于100 mL容量瓶中，一级水定容至刻度，配制成浓度分别为0.04 mg/L、0.08 mg/L、0.16 mg/L、0.40 mg/L、0.80 mg/L的标准工作液。

1.2.2 样品前处理方法

用移液管准确移取10 mL 白酒样品于蒸发皿中，放于沸腾水浴锅上，蒸发至近干后用纯水定容至10 mL，并摇匀。用一次性2.5 mL 注射器吸取均质样品，经0.22 μm的有机滤膜过滤至1 mL进样瓶中，供液相色谱-质谱联用仪上机检测。

1.2.3 色谱条件

(a)色谱柱：C18柱（柱长150 mm，柱内径2.1 mm，填料粒径1.8µm）；

(b)流动相：A 相：0.1 %甲酸溶液；B 相：乙腈溶液；

(c)流速：0.15 mL/min；

(d)柱温：40 ℃；

(e)进样量：2 μL。

1.2.4 质谱条件

(a)离子源类型：电喷雾离子源；

(b)扫描方式：正离子模式；

(c)毛细管电压：3000 V；

(d)离子源温度：350 ℃；

(e)雾化气：30 psi；

(f)多反应监测：选择至少2个子离子。

2 结果与分析

2.1 色谱条件和质谱条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化

将液相部分色谱柱换为两通连接，采取直接进样的方式，将配制的纯品目标物标准溶液注入质谱，分别进行正离子模式和负离子模式，在Scan 状态下进行全扫描检测，得到TIC 总离子流图，根据总离子流图标记出特征离子峰，即得到一级质谱图和准分子离子峰，再进行SIM 模式扫描，将标记出的准分子离子峰进行单独扫描，得到EIC 提取离子流图；再用碰撞气惰性气体氮气攻击该前体离子，获得其二级质谱图及相应的子离子。结果表明在正离子模式下响应值及灵敏度均高于负离子模式，因此，本方法选择正离子电离模式。利用多反应监测模式（MRM)）对选定的定性离子和定量离子对裂解电压、毛细管电压、碰撞能、保留时间、碰撞池加速电压等质谱参数进行优化，使各监测离子丰度和信号达到最佳。正离子模式下的质谱分析参数见表1。

表1 氨基甲酸乙酯的质谱参数

2.1.2 色谱条件的优化

通过对氨基甲酸乙酯物理和化学信息的分析，分别以0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、5 mmol/L甲酸铵-乙腈、5 mmol/L 甲酸铵-甲醇作为流动相进行样品分离。由于不同流动相的pH 值不同，对色谱柱中的填料物质会起到一定的作用，有的流动相有利于目标物质的分离，有的流动相则会抑制目标物出峰，导致峰形异常，如峰拖尾、峰前伸、双头峰，以及鬼峰等现象，均不利于对样品进行定性以及定量分析。通过利用以上流动相对氨基甲酸乙酯进行色谱峰分离，结果表明，用0.1%甲酸-乙腈作为流动相时物质分离度、峰形、响应值以及保留时间的稳定性均优于0.1%甲酸-甲醇、5 mmol/L甲酸铵-乙腈、5 mmol/L 甲酸铵-甲醇，故本方法最终选用0.1 %甲酸-乙腈为流动相进行洗脱。图3 是氨基甲酸乙酯在优化的色谱和质谱条件下的MRM色谱图。

图1 氨基甲酸乙酯离子质谱图

图2 不同流动相色谱图对比

图3 氨基甲酸乙酯的多反映监测色谱图

图4 氨基甲酸乙酯母离子及子离子色谱图

2.2 线性范围、检出限和定量限

将氨基甲酸乙酯标准储备液用一级水稀释，分别配制成浓度为40 μg/L、80 μg/L、160 μg/L、400 μg/L、800 μg/L 的标准工作液，按1.2 节所述的色谱-质谱条件进行测定，绘制标准工作曲线，如图5 所示。参考标准GB/T 27417—2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》中5.4 检出限和定量限的评定方法规定，信噪比法评估检出限和定量限，检出限可接受的信噪比为3∶1，定量限可接受的信噪比为10∶1。本方法为保证实用性，模拟氨基甲酸乙酯在白酒中的状态，由于目前市面上的白酒酒精度大多在42%vol和52%vol，本方法利用购买的无水乙醇，配制成酒精度为46%vol 的白酒模拟样品，在白酒模拟样品中添加氨基甲酸乙酯标准储备液，进行方法探底试验。既要保证信噪比可接受，也要保证峰形易识别，且峰形无异常，如图6所示。

图5 氨基甲酸乙酯的线性相关系数

图6 检出限和定量限信噪比

结果显示，在40～800 μg/L 的浓度范围内，分析物氨基甲酸乙酯的质量浓度x(ng/mL)和响应值y之间线性相关系数为0.999；模拟样品中添加浓度为10 μg/L 时，信噪比为6 大于3，峰形易识别且无异常，即确定为检出限；浓度为20 μg/L信噪比为15大于10，峰形易识别且无异常，故确定为定量限。

2.3 精密度和回收率

为充分保证相关样品检测数据的准确有效，本试验分别准备3 种常见的不同香型白酒样品，浓香型白酒、酱香型白酒和清香型白酒，并在3 种白酒样品中分别加入按标准工作曲线浓度最高点的0.1倍、0.5倍和0.9倍的标准溶液，配制成低中高3种浓度的加标样品溶液，按照给定分析方法的全过程进行处理和测定，记录6 个平行样的测定结果，按全程序每个样品平行测定6 次，分别计算每个样品的加标回收率，统计其相对标准偏差，见表2、表3、表4。

表2 样品1加标回收率计算

表3 样品2加标回收率计算

表4 样品3加标回收率计算

参考公式：

加标回收率=(加标试样测定值-试样测定值)/加标量×100%

由表2 可知，本实验中检测结果的重复性相对标准偏差（变异系数）均小于10 %，且加标回收率均在95%～115%之间，满足方法验证学要求。

2.4 与国标法比对

选择市面上常见的3 种香型白酒，浓香、清香和酱香，按照本方法和食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定GB 5009.223—2014 分别进行样品前处理以及上机检测。本方法采用除醇方式对白酒样品进行前处理，液相色谱-质谱联用仪进行检测，外标法定量分析；国标GB 5009.223—2014采用萃取、分液及氮吹等方式对样品进行前处理，气相色谱-质谱仪进行检测，内标法定量分析。3种香型白酒的检测比对结果见表5。

表5 方法结果比对 (μg/L)

由表5 可知，不同香型白酒氨基甲酸乙酯含量差别比较大，将本方法和国标方法的数据进行比较，相对偏差均小于10 %，由此可知，对于不同浓度的白酒样品，本方法与国标方法检测结果相差不大，能满足检测要求。

3 结论

本研究利用液相色谱-质谱联用仪分析了白酒中氨基甲酸乙酯化合物的分子信息，利用多反应监测模式的液相色谱-质谱联用技术，建立了快速、稳定、灵敏的可定性定量分析氨基甲酸乙酯的方法。该方法可在8 min内完成，经过多种方法学验证，其检测范围内线性良好（r=0.999）；检出限0.01 mg/L；定量限0.02 mg/L；精密度小于10 %；回收率大于95%；并且在与国标方法检测结果比较中，检测结果相对偏差均小于10 %。对于不同香型白酒，氨基甲酸乙酯浓度各异。由结果可知本方法与国标方法偏差较小，满足使用要求。与国标中的检测方法相比本方法前处理更加方便快捷，便于日常对白酒中氨基甲酸乙酯的含量进行监控。综上所述本方法可以对白酒中氨基甲酸乙酯进行实际的定性定量分析检测。