茅尾海红树根际土壤可培养细菌多样性及抑菌活性研究

李王靖, 李 蜜, 徐淑芬, 黎芳婷, 易湘茜, 刘永宏, 高程海*

( 1. 广西中医药大学 海洋药物研究院/药学院, 南宁 530200; 2. 广西海洋药物重点实验室, 南宁530200 )

红树植物因受潮汐活动影响而长期被海水周期性淹没,独特的生境蕴藏丰富且特殊的微生物资源,由于生长环境特殊及现有分离技术手段有限,因此仅1%的红树林微生物资源可通过现有分离方法获得(李蜜等,2020)。广西茅尾海红树林地处亚热带海湾,海水温度较高且盐度较低, 适宜桐花树和秋茄等乡土红树植物生长,近几年从国外引入大量无瓣海桑(黄祥娟等,2022),具有生态系统复杂、微生物群落结构特殊和活性微生物多样性丰富等特征。颜栋美等(2018)从茅尾海无瓣海桑根际土壤中,分离获得57株细菌,其中有1株潜在新菌种,50.88%的菌株对甘蔗鞭黑粉菌具有抑制作用。郑红芸等(2019)从茅尾海红树植物根际淤泥中获得244株放线菌,60株隶属链霉菌属,4株为潜在新物种。抑菌实验结果显示,83株放线菌中有59株对多种致病菌具有抑制作用,包括1株潜在新菌,6株细菌表现出广谱的抑菌活性。叶景静等(2018)使用8种培养基从3种红树植物中分离获得261株细菌,其中3株为潜在新物种,83株放线菌中有10株具有广谱抑菌活性。Lu等(2019)从茅尾海红树植物土壤的1株小单孢菌中分离得到对耐药大肠杆菌和药敏肺炎克雷伯菌有较强抑制活性的7个喹诺啉类抗生素,包括quinomycin A, quinomycin monosulfoxide和5个新化合物。Li等(2019)和Gong等(2018)从茅尾海红树林分别发现5株具有产生核糖体抑制剂的细菌和16株含有I型聚酮合酶和II型聚酮合成酶的菌株。由此可见,茅尾海红树林菌株资源丰富,部分菌株对多种致病菌有抑菌效果且活性显著,有开发成为抗生素的潜力。

富集培养作为一种分离未培养和难培养微生物的方法,被验证能够有效促进海洋细菌从休眠状态下复苏(王肖慢等,2019),分离得到多样性丰富的微生物。该方法已在海洋沉积物中被应用,Mu等(2018)研究结果显示,富集培养后同一样品相比传统培养方法微生物物种多样性提高2倍以上。目前还未有文献报道使用富集培养法富集红树林根际土壤微生物。因此,本研究使用该方法富集微生物提高其物种多样性,具有较大研究价值。

抗生素作为人类对抗感染性疾病的有效武器,在人类社会中扮演着重要角色。由于抗生素在农业、医疗等各个领域的滥用,因此促使了致病菌耐药性的产生,从而推动了抗生素耐药危机爆发(王旭阳等,2020),人类将面临无有效抗生素可用的“后抗生素时代”。预计到2050年,抗生素耐药危机每年可能造成约1 000万人死亡(El-Kurdi et al.,2020)。2014—2019年临床研究结果显示,金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和铜绿假单胞菌是临床上最为常见的人体致病菌,对当前常见的抗生素具有耐药性(全国细菌耐药监测网,2021)。因此,开发新型有效的抗生素迫在眉睫,而寻找能够产生新型抗生素的菌株是前提条件。本研究以茅尾海不同种类红树植物根际土壤为对象,首次尝试用富集培养法分离共生细菌,用纸片法对菌株代谢产物粗提物进行抑菌活性筛选,拟探讨:(1)富集培养法能否从红树植物根际土壤中分离得到多样性丰富的微生物;(2)富集培养法能否有效从红树植物根际土壤中分离到未培养和难培养的微生物;(3)红树林环境样品是否存在具有抑菌活性的微生物资源。以期挖掘更多潜在新物种和具有抑制人类致病菌活性的微生物资源,为抗生素的开发提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 根际土壤样品的采集 2021年9月于茅尾海红树林自治区级自然保护区采集红树植物红海榄、黄槿、无瓣海桑、桐花树、阔苞菊的根际泥土样本。采集5～10 cm深度的红树植物根际土壤,除去石块和断根等杂质后装入无菌采样袋存放于4 ℃保温箱中,带回实验室进行菌株分离实验。样品采集信息详情如表1所示。

表 1 茅尾海红树根际土壤样品采集的信息Table 1 Information of collected mangrove rhizosphere soil samples from the Maowei Sea

1.1.2 检定菌来源 表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)由广东省微生物研究所提供。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus)由广西中医药大学海洋药物研究院提供。

1.1.3 主要试剂及仪器设备 二甲基亚砜(DMSO)和甲醇为国产分析纯,购于西陇科学股份有限公司;聚合酶链式反应引物(27F, 1492R)购于北京全式金生物技术有限公司;Chelex-100 树脂购于美国 BioRad 公司;Taq PCR Master Mix (2 ×)购于康为世纪生物科技股份有限公司。

1.1.4 培养基 富集培养基:氯化铵1.0 g,乙酸钠2.0 g,七水硫酸镁0.20 g,酵母提取物0.20 g,蛋白胨0.20 g,EDTA-Na21.0 g,丙酮酸钠1.1 g,海水1 L,灭菌后另加无菌的10% NaHCO3和2% KH2PO4溶液(10 mL·L-1)。分离培养基:参考李蜜等(2020)使用2216E琼脂培养基(2216E)、2216E/10培养基、酪氨酸-天冬酰胺培养基(P7)、改良ISP5培养基(M7)、Am6-1培养基、燕麦培养基(P3)。灭菌后添加重铬酸钾使其终浓度为25 mg·L-1。纯化及保藏培养基:ISP2和LB固体培养基。发酵培养基:AM3和AM6液体培养基。检定菌培养基:LB固体培养基。

1.2 方法

1.2.1 土壤样品的处理 参照王肖慢等(2019)的方法,取20 g土壤加入灭菌后的500 mL液体富集培养基(Mu et al.,2018)中,震荡混匀,置于28 ℃恒温箱静置培养,分别于第0天和第7天取原液、10-1和10-3稀释液,在6种不同的分离培养基上涂布培养(李蜜等,2020)。

1.2.2 菌株的分离纯化和保藏 参考李蜜等(2020)的方法,将涂布后的培养基置于28 ℃恒温培养箱培养,分别于第5、第17、第41天从涂布培养基中挑选单一菌落,采用三区划线法在ISP2培养基上分离纯化,编号且记录其生长培养基类型和形态特征;将纯化的菌株保藏于25%(M/M)无菌甘油管中。

1.2.3 菌株的鉴定 纯化的菌株根据形态特征进行排重,采用Chelex-100法(周双清等,2010)对已排重细菌的基因组DNA进行提取,参照Walsh 等(1991)的方法对细菌基因组DNA进行PCR扩增。将扩增产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。经SeqMan软件整理16S rRNA基因测序结果,并在数据库EzBioClou(http://www.eztaxon.org/)进行相似性比对,根据16S rRNA相似度对菌株的种属进行确定。

1.2.4 可培养细菌活性筛选

1.2.4.1 可培养细菌粗提物的提取 参考李蜜等(2020)的方法,将对数生长期的菌株分别接种于100 mL的AM3和AM6液体培养基中,在28 ℃、180 r·min-1恒温振荡培养箱中发酵7 d。用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液3次,取乙酸乙酯萃取溶液进行减压旋蒸,挥干得到细菌粗提物,粗提物置于4 ℃环境保存。

1.2.4.2 细菌粗提物的抑菌实验 参考郑红芸等(2019)的方法,将致病菌接种于50 mL LB液体培养基中,在37 ℃、180 r·min-1的摇床中培养7 h获得种子液。种子液加到未凝固的LB固体培养基中灭菌后冷却至50 ℃左右的LB固体培养基中,稀释至0.2%浓度。充分振摇后倾注到培养皿中,待其冷却后备用。

参考叶景静等(2018)的方法。使用甲醇溶解细菌粗提物,最终配制成20 mg·mL-1溶液,取15 μL分多次滴加到直径6 mm的无菌滤纸片中。等体积甲醇、DMSO、空白AM3培养基、空白AM6培养基的滤纸片作阴性对照。以分别加入3 μL甲氧苄啶和环丙沙星的滤纸片作为阳性对照。37 ℃恒温培养箱培养24小时,观察抑菌结果。

2 结果与分析

2.1 可培养细菌多样性分析

使用6种分离培养基从7份红树植物根际土壤样品中分离到266株可培养细菌。根据菌株的形态特征和生长情况进行排重,通过16S rRNA基因序列测序比对,鉴定获得120种细菌,包括放线菌门、厚壁菌门和变形菌门,隶属于35科47属,分离情况如表2所示。红树植物根际土壤中放线菌资源丰富,分离得到49种放线菌占分离菌株总数的40.8%。链霉菌属 (Streptomyces)分离获得最多,共17种,占细菌物种总数的14.2%;其次为芽孢杆菌属(Bacillus),共获得9种。分离得到5种潜在新菌,与有效发表菌株相比较最高相似度均低于97.00%,其中MarmoricolasilvestrisGXIMD2799、ActinomycetosporachiangmaiensisGXIMD3297、ShewanellamangroviGXIMD2807、FulvimarinamanganoxydansGXIMD2794均来源于桐花树的根际土壤,详细物种信息如表3所示。

2.2 不同样品和培养基的获得菌株种类分析

经过富集培养处理后,不同样品获得可培养细菌多样性差异明显,样品B(黄槿根际土壤)中分离得到的菌种数目最多(为43种),优势菌属为微杆菌属(Microbacterium)。其次是样品F(桐花树根际土壤)分离得到35种细菌,链霉菌属最为丰富。样品E(桐花树根际土壤)中分离得到的菌种数目最少,而放线菌占比最高(57.89%)。此外,各样品中均能分离得到芽孢杆菌属和希瓦氏菌属(Shewanella)菌株。不同样品菌株分离情况如图1所示。

由于不同培养基存在营养成分差异,因此分离得到的细菌物种多样性差异显著。就菌种多样性而言,P7培养基分离效果最好,获得60种细菌,隶属于18个属,其中56.67%为放线菌,链霉菌属最为丰富。P3培养基和2216E培养基分离得到的菌株数目最少,分别得到11种和14种菌,隶属于10个属和12个属,优势菌属为链霉菌属。与2216E培养基相比,具有相同种类成分的2216E/10培养基分离得到的菌株种类更为多样,共获得35种菌,隶属于20个属。此外,壤霉菌属(Agromyces)、芽孢杆菌属、链霉菌属和Rossellomorea在6种分离培养基中均有生长。不同培养基菌株分离情况如图2所示。

2.3 细菌发酵产物的抑菌实验结果

9种菌株对至少一种致病菌有抑菌活性,其中7种分离自P7培养基。菌株StreptomyceshyderabadensisGXIMD3077、AgromyceskandeliaeGXIMD3249、StreptomycessundarbansensisGXIMD3242、CurtobacteriumluteumGXIMD3684、MicromonosporarifamycinicaGXIMD3699对3种人体致病菌均具有抑制活性。GordoniadidemniGXIMD3861、ShewanellaalgaeGXIMD3241对MRSA和铜绿假单胞菌具有抑制活性。NocardiaarthritidisGXIMD3088、GXIMD3297对铜绿假单胞菌具有一定的抑制活性。放线菌在抑菌活性研究方面有较大潜力,通过筛选发现8种活性菌株为放线菌,2种来源于链霉菌属,其余6种菌株分别来自壤霉菌属、短杆菌属(Curtobacterium)、小单孢菌属(Micromonospora)、戈登氏菌属(Gordonia)、诺卡氏菌属(Nocardia)和放线孢菌属(Actinomycetospora),其中GXIMD3297为潜在新菌,对铜绿假单胞菌具有一定的抑菌活性。同一菌株不同发酵培养基其代谢产物抑菌活性检测结果不同,部分菌株的抑菌活性只存在于其中一种发酵培养基的代谢产物,9株活性菌株中GXIMD3699和GXIMD3061在2种发酵培养基的代谢产物均有抑菌活性。抑菌活性实验结果如表4和图3所示。

3 讨论

茅尾海红树林海水盐度较低且红树植物种类多样,其根际土壤微生物群落复杂。据2015—2021年的文献报道,通过传统分离方法从茅尾海红树林土壤分离得到的潜在新菌(<98.65%)比例为2.34% (张荣灿等,2015;吴家法等,2017;颜栋美等,2018;叶景静等,2018;石松标等,2018;郑红芸等,2019)。由于海洋环境难以模拟、某些微量的营养物质缺失、不同微生物之间的生物联系切断等制约条件,导致部分微生物为避免外界环境威胁,启动自我保护机制而陷入休眠状态(王保军等,2013),因此在实验室分离得到的菌株种类极其有限。为分离未培养和难培养微生物,本研究采用富集培养法富集土壤样品中的微生物,以期复苏休眠菌株,提高微生物多样性,获得更多潜在新物种,最终分离得到5株相似度低于97.00%的菌种,潜在新菌比例为4.17%。富集培养所用培养基是在寡营养培养基的基础上添加了丙酮酸钠和乙酸钠,为合成细菌生长所需的丙酮酸和乙酰辅酶A提供底物,进而增强细菌基础代谢,促进细菌复苏,同时降解富集过程中细菌产生的有害代谢产物,在富集过程中打破部分微生物的受胁迫状态(Mu et al.,2018;王肖慢等,2019),使其可以正常生长,尽可能多的分离出未培养和难培养细菌。

图 1 不同茅尾海红树根际土壤分离得到的细菌种类Fig. 1 Bacteria isolated from different mangrove rhizosphere soils of the Maowei Sea

图 2 不同培养基分离得到的细菌总数Fig. 2 Total number of bacteria isolated from different media

表 2 茅尾海红树林样品根际土壤可培养细菌Table 2 Culturable bacteria of mangrove rhizosphere soil from the Maowei Sea

表 3 潜在疑似新物种Table 3 Potential new species

本研究在富集培养的基础上,采用6种分离培养基对茅尾海7份不同地点的红树植物根际土壤进行细菌的分离纯化,共获得120种细菌,隶属于35科47属,链霉菌属数量最多,优势属与叶景静等(2018)、郑红芸等(2019)研究结果相同。不同培养基的菌株分离结果显示,P7培养基(甘油、L-酪氨酸、L-天冬酰胺、复合盐溶液)分离得到的菌株多样性最丰富,共分离得到60种细菌,占总菌种数的50.00%,包括7种活性菌株。P3和2216E培养基营养丰富,分离效果逊于寡营养的P7培养基。这说明在红树林特殊生境中,较多微生物的生长需要补充氨基酸,并要求培养基微量元素多样、非营养丰富,P7培养基可作为红树植物根际土壤微生物分离的参考培养基。

放线菌是抗生素的主要来源,为应对抗生素耐药危机提供重要菌种资源。抑菌活性筛选结果显示,有9种细菌具有抑菌活性, 其中8种为放线菌。GXIMD3077、GXIMD3249、GXIMD3242、GXIMD3684、GXIMD3699对3种人体致病菌均有一定的抑制作用。GXIMD3249为秋茄壤霉菌(Agromyceskandeliae),最早发现于2020年(Wang et al., 2020),目前未见有抑菌活性方面的报道。GXIMD3699和GXIMD3061在两种发酵培养基的代谢产物均有抑菌活性,其余活性菌株只筛选到一种培养基的代谢产物具有活性,说明培养基的组成变化对菌株的次级代谢产物合成有一定的影响(孙志敏等,2022)。铜绿假单胞菌是临床上常见的病原菌,容易感染人体导致肺炎、菌血症和败血症等,对于免疫力低下人群具有严重的危害。其外膜通透性较低,并能产生碳青霉烯酶和多种β-内酰胺酶对抗生素进行灭活,对多种常用抗菌药物具有明显耐药性(岳卓等,2020)。本研究分离得到1株最高相似度为96.61%的稀有放线菌GXIMD3297(Actinomycetosporachiangmaiensis),为潜在新物种,该菌在AM6液体培养基中的代谢产物对铜绿假单胞菌具有一定的抑制作用。据文献报道,该属菌株仅在兰花(Sakdapetsiri et al., 2018)、地衣(Yamamura et al., 2011)和土壤(Zhang et al., 2014)中被发现,目前暂无关于该属抑菌活性的相关研究。因此,本研究筛选到的潜在新物种GXIMD3297具有深入开发研究的潜力。下一步计划开展潜在新菌的多项分类鉴定及活性菌株的条件优化、活性化合物分离纯化等,为新型抗生素的研发提供科学基础。

1. 铜绿假单胞菌; 2. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌; 3. 表皮葡萄球菌; A. AM3培养基; B. AM6培养基; C. 甲醇; D. 二甲基亚砜; E. 甲氧苄啶; F. 环丙沙星。1. Pseudomonas aeruginosa; 2. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; 3. S. epidermidis; A. AM3 medium; B. AM6 medium; C. MeOH; D. DMSO; E. TMP; F. CPFX.图 3 3种人体致病菌抑菌活性实验结果图Fig. 3 Results of antibacterial activity from three kinds human pathogenic bacteria

表 4 具有抑制3种人类致病菌活性的红树林根际土壤可培养菌株Table 4 Culturable strains of mangrove rhizosphere soil with inhibitory activity against three human pathogenic bacteria

4 结论

本研究结果可为富集培养方法在红树植物根际土壤微生物分离的应用提供参考。从茅尾海红树植物根际土壤中分离得到120种细菌,包括5种潜在新物种,说明茅尾海红树植物根际土壤蕴藏的微生物资源丰富,具有较大的开发价值。抑菌实验结果显示,8种放线菌对多种致病菌表现出抑制作用,其中包括1株潜在新菌,说明海洋放线菌是新型抗生素生产来源的潜力菌株,并且具有较大研究潜力。