N6-腺苷酸甲基化修饰及其在肝脏疾病中的作用概述

王子硕 徐晓军

中国药科大学药物科学研究院，江苏南京 210009

N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine，m6A）修饰是指在腺苷酸的第六位氮原子上添加一个甲基基团[1]，它由一系列调节因子催化，这些调节因子相互作用，共同发挥生物学作用。m6A修饰影响着核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）的衰变、转录、剪接、输出、翻译、定位和稳定性等生物学过程，调节下游信号通路和生理功能[2-4]。然而，目前这些研究仍然不能全面揭示m6A修饰的深奥秘密，尤其是在肝脏相关疾病中的生理病理作用，包括非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）等。肝脏是病理生理过程中的一个重要器官，具有广泛的功能，包括营养代谢、解毒、蛋白质合成和消化所需的生化物质的产生。m6A修饰高度调节肝功能和肝病的发展。本文旨在总结已鉴定的m6A修饰调节因子及其在肝脏疾病发生过程中的作用，包括肝脏脂质代谢相关疾病（NAFLD、NASH）和HCC等。

1 m6A修饰简介

m6A修饰是一种动态且可逆的事件，可以在时间及空间上以不同形式进行双向调节。作为最丰富的转录后修饰，它由一系列调节因子催化，包括甲基化酶、去甲基化酶和特定的RNA阅读蛋白（结合蛋白）[5]。其中m6A甲基转移酶也称为“writers”，负责诱导RNA发生m6A修饰[6]；m6A去甲基化酶也称为“erasers”，负责直接去除发生甲基化RNA的m6A修饰[7]；特定的RNA阅读蛋白也称为“readers”，负责特异性识别m6A修饰的RNA的不同子集[8]或与m6A基序结合，赋予特定的表型结果[9]。通常m6A修饰各调节因子相互作用，并与其他组件形成一个大型复合体发挥作用，如甲基化酶发挥甲基化作用需要依赖于阅读蛋白[6]。这种相互作用涉及多种生理功能和过程，在细胞增殖、脂质代谢、NAFLD、NASH、肿瘤发生和转移中发挥着独特的作用。

2 m6A修饰调节因子

2.1 m6A甲基化酶

m6A甲基化酶主要包括甲基转移酶3（methyltransferase like 3，METTL3）、甲基转移酶14（methyltransferase like 14，METTL14）、“Wilms”肿瘤1相关蛋白（wilms tumor 1-associated protein，WTAP）、RNA 结合基序蛋白15（RNA binding motif protein 15，RBM15）、甲基转移酶5（methyltransferase like 5，METTL5）、含锌指的CCCH结构域蛋白13（zinc finger CCCH domain-containing protein 13，ZC3H13）和含锌指的CCCH结构域蛋白4（zinc finger CCCH domain-containing protein 4，ZCCHC4）等。

METTL3是一种S-腺苷甲硫氨酸结合亚基，与信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）甲基化有关。METTL14是m6A甲基转移酶复合物的另一个活性成分。METTL3和METTL14在核斑点中共定位，并以1∶1的比例形成稳定的复合物。METTL3是主要的催化核心，在细胞质中以不依赖m6A的方式优先促进某些表观遗传因子mRNA翻译促进肿瘤进展[10]。

WTAP是m6A甲基转移酶复合物的第三个关键成分，WTAP作为调节亚基的一种甲基转移酶复合物，在基因表达和可变剪接的调控中起关键作用[11]。

RBM15也被认为是甲基转移酶，参与RNA剪接和细胞命运，在肿瘤发生等病理生理中起关键作用[12]。但RBM15如何具体在m6A修饰过程中发挥甲基化作用尚不清楚。

ZC3H13和ZCCHC4以及METTL5都是新发现的甲基化调控因子，是新的甲基转移酶[13]。

2.2 m6A去甲基化酶

m6A去甲基化酶是指甲基化RNA中的N6-甲基腺苷可以被该类酶去除，其作用是确保m6A甲基化是一个动态和可逆的过程，其成员包括脂肪量和肥胖相关蛋白（fat mass and obesityassociated，FTO）、ALKB 同系物5（ALKB homolog 5，ALKBH5）等[14-15]。

FTO是第一个被发现的m6A去甲基化酶。FTO对RNA中丰富的N6-甲基腺苷残基具有高效的氧化去甲基化活性，并影响体内细胞RNA中m6A的含量[16-17]。

ALKBH5被鉴定为第二种具有生物学功能的去甲基化转移酶，与核斑点共定位并影响mRNA的输出及代谢过程。ALKBH5敲低导致轻微增加而过表达则轻微减少细胞mRNA中的m6A水平[15]。

2.3 m6A阅读蛋白

m6A阅读蛋白是指能够识别和结合m6A修饰的蛋白质，能够解码m6A标记并产生功能信号，导致靶RNA产生不同的归宿[4，18]。其成员包括YT521-B同源结构域家族蛋白（YT521-B homologous structural domain protein，YTHDF1/2/3和YTHDC1/2）和胰岛素样生长因子 2型 mRNA 结合蛋白（insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein，IGF2BPs）等。

YTHDF1、YTHDF3促进或抑制靶向mRNA的翻译，从而影响基因表达[2，19-20]。YTHDF2能够招募前体mRNA的剪切因子，调节mRNA的剪切和衰变，促进mRNA降解[3]。YTHDC2和YTHDC1一样都属于细胞核中的YTH结构域蛋白，也能够影响m6A修饰的RNA剪切和核输出过程。YTHDC2是最大的含YTH结构的蛋白，可通过在其共有基序处选择性结合m6A来提高其靶标的翻译效率并降低其mRNA丰度[4]。

最新研究发现，IGF2BPs被认为也能够结合m6A甲基化位点并发挥识别蛋白作用，维持靶mRNA的稳定性并促进其翻译[21]。

3 m6A与肝脂质代谢

肝脏中异常的脂质积累导致NAFLD，而持续性脂肪变性和炎症促进NAFLD向NASH的进展，NAFLD-NASH-HCC的进展是肥胖和代谢综合征的肝脏后果。越来越多的证据表明m6A修饰的调节因子甲基化酶、去甲基化酶和阅读蛋白对肝脏脂质代谢、NAFLD和NASH均具有重要的调节作用。

3.1 甲基化酶与肝脂质代谢

METTL3或METTL14增加m6A甲基化水平，改善脂多糖诱导的肝脏损伤和脂质代谢紊乱。METTL3抑制细胞周期调节因子细胞周期素D1（cyclin D1，CCND1）[22]的表达从而抑制脂肪生成，减少脂质沉积并降低脂肪细胞甘油三酯（triglycerides，TG）含量。矛盾的是，有研究发现METTL3在脂肪肝疾病中扮演着促进的作用，如METTL3通过调节酸敏感离子通道1a（acid-sensing ion channel 1a，ASIC1a）对微小RNA（microRNA，miR-350）的加工和成熟，靶向侧支发芽因子同源物2（recombinant sprouty homolog 2，SPRY2），并通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）和细胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）途径促进肝纤维化和脂肪变性[23]。

METTL3在调节肝脏脂质稳态中的相互矛盾的复杂作用暗示m6A修饰在生物学过程中的复杂性，这种相互矛盾的作用可能归因于METTL3自身充当m6A甲基化酶的作用，也可能是由于其自身发挥的转录抑制因子作用。此外，由于METTL3仅仅是m6A甲基化复合物的成分之一，因此也不能排除甲基化复合物中其他成分对METTL3的影响。

另一甲基化酶METTL14促进NAFLD进展，过表达的METTL14与ATP柠檬酸裂解酶（adenosine triphosphate-citrate lyase，ACLY）和硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearoyl-CoA-desaturase，SCD1）的mRNA结合并改变它们的表达模式，增加ACLY和SCD1的蛋白质水平从而促进甘油三酯和胆固醇的产生和脂滴的积累，促使脂质代谢紊乱，诱发NAFLD模型[24]。

3.2 去甲基化酶与肝脂质代谢

FTO以其对脂肪生成和代谢的影响而闻名，密切参与肝脏脂质代谢的各个方面。在肝脂肪变性小鼠和人类NAFLD和NASH患者的肝脏中均观察到FTO 的mRNA和蛋白质水平明显升高。FTO促进了固醇调节元件结合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein，SREBP-1c）和碳水化合物反应元件结合蛋白（carbohydrate response element binding protein，ChREBP）mRNA的稳定性和翻译，促进脂质积累[25]。FTO还可以通过调节抑制过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferators-activated receptors α，PPARα）的表达促进肝脂肪变性[14]。

ALKBH5在小鼠和人肝纤维化组织中显著下调，ALKBH5通过m6A依赖性方式介导补缀同源物 1（recombinant patched 1，PTCH1）的活化，导致刺猬（hedgehog，Hh）信号通路失活，抑制肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的激活并改善肝纤维化[15]。这些发现为ALKBH5介导的m6A去甲基化在肝纤维化中的关键作用提供了见解。

3.3 阅读蛋白与肝脂质代谢

FTO通过以m6A-YTHDF2依赖性方式调节脂肪生成，说明m6A各调节因子之间相互作用共同介导病理生理过程。这也暗示m6A阅读蛋白在肝病的发展中也发挥着关键作用。

YTHDF1的敲低阻止了双氢青蒿素（dihydro artemisinin，DHA）诱导的HSCs的铁死亡，使DHA减轻肝纤维化的作用失效[26]。

YTHDF2可通过调控PPARα的转录与翻译，影响脂代谢的昼夜节律，维持生物钟的稳定，减少肝脂质代谢疾病的发生。YTHDF2的下调抑制脂肪生成基因的mRNA降解，导致脂肪生成增加和过多的脂质积累[19]。

YTHDF3可以识别并结合过氧化还原酶3（recombinant peroxiredoxin 3，PRDX3）的mRNA，调节PRDX3的翻译和表达并降低肝纤维化[18]。

YTHDC2在肥胖小鼠和NAFLD患者的肝脏中均显著下调。敲降YTHDC2导致TG含量积累，而过表达YTHDC2改善了肝脏脂肪变性和胰岛素抵抗。在机制上，YTHDC2可以与脂肪生成基因的mRNA结合，降低其mRNA稳定性并抑制其基因表达，从而抑制脂肪生成以调节TG稳态，抑制肝脂肪变性[4]。

综上所述，无论是甲基化酶、去甲基化酶还是阅读蛋白，这些m6A调节因子在与肝脂质代谢等相关疾病中均扮演着重要作用，然而，目前m6A修饰在调控肝脂质代谢疾病过程中具体的分子机制仍有诸多问题待解决，甚至出现相互矛盾的观点，而各协调因子在调控肝脂质代谢疾病过程中相互协调机制也仍未阐明。尽管HFD喂养的小鼠模型已被用于研究m6A在NAFLD和NASH中的作用，但仍然缺乏使用人类样本的转录组范围的m6A映射数据。此外，还需要进一步的研究来阐明m6A调节因子在NAFLD-NASH-HCC轴进展过程中的多功能作用。

4 m6A与肝细胞癌

HCC是全球第六大常见癌症和第三大癌症相关死亡原因，已在全球范围内造成严重的健康负担，其发病率持续上升[27]。

4.1 甲基化酶与肝细胞癌

METTL3通过m6A-YTHDF2依赖性机制促进细胞因子信号抑制因子2（Suppressor of cytokine signaling，SOCS2）的降解，促进HCC进展[28]。然而，这项研究既没有显示人类原发性HCC中的METTL3蛋白水平，也没有探讨正常肝细胞中METTL3耗竭的后果。不过在其他研究中也发现METTL3在HCC中上调[10]。

METTL14异常导致发生HCC的风险增加[29]，METTL14与ACLY和SCD1的mRNA结合并改变其表达模式，从而诱发NAFLD小鼠模型，并自发进展为NASH，纤维化和HCC的组织学特征。然而，低水平的METTL14也被认为是HCC患者预后不良的标志物。目前METTL14在HCC中的机制尚不明确，需要进一步地研究和探索。

METTL3和METTL14在甲基化中的不同作用可能是它们在HCC中相互冲突的表达变化的基础。此外，METTL3而非METTL14发挥甲基转移酶独立功能以增强mRNA翻译，这也可能有助于解释它们的不同表达和生物学功能。总之，METTL3和METTL14可作为潜在的治疗靶点。

4.2 去甲基化酶与肝细胞癌

FTO介导环状RNAs（circGPR137B）的m6A去甲基化并促进其表达，由此形成了一个由circGPR137B、miR-4739和FTO组成的反馈回路，抑制HCC的肿瘤发生和转移[30]。

ALKBH5在HCC中表达上调[17]，不过也有报道ALKBH5作为肿瘤抑制因子在HCC中低表达[16]。在机制上，ALKBH5通过ALKBH5-丝裂原活化蛋白激酶激酶8（mitogen activated protein kinase 8，MAP3K8）轴和肿瘤易感候选基因11（cancer susceptibility candidate 11，CASC11）-ALKBH5-泛素结合酶2（recombinant ubiquitin conjugating enzyme E2，UBE2）轴促进HCC进展，促进肝癌细胞的增殖和转移；或通过ALKBH5-Ly6/PLAUR结构域包含蛋白1（Ly6/PLAUR domain-containing 1，LYPD1）轴抑制HCC细胞生长和侵袭。

以上相互矛盾的研究观点说明ALKBH5介导HCC效应的复杂性，这或许取决于特定的组织环境和不同的下游分子。不过，这从侧面反映了ALKBH5在HCC中具有重要的调节作用。

4.3 阅读蛋白与肝细胞癌

YTHDF1在HCC中显著上调，通过激活AKT-糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）-β连环蛋白（β-catenin）信号通路[20]和PI3K-AKT-雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路[2]并诱导上皮间质转化，促进HCC细胞的迁移和侵袭等恶性行为。

YTHDC1下调高迁移率族AT Hook蛋白2（high mobility group AT Hook protein 2，HMGA2）的表达，加速肝细胞癌的肿瘤发生[31]。

YTHDF2也在HCC中高度表达，YTHDF2通过促进METTL3介导的SOCS2 m6A修饰，诱导HCC细胞的增殖、迁移和集落形成[28]。此外，YTHDF2还可以通过调节八聚体结合转录因子4（monoclonal antibody to octamer binding transcription factor 4，OCT4）mRNA的m6A甲基化促进肝癌干细胞数量和肝脏表型，增强体内肿瘤负荷和癌症转移[32]。然而，还有一些研究发现YTHDF2在HCC中低表达[3]。相反的结果表明YTHDF2可能同时作为致癌因子或肿瘤抑制因子发挥双重作用。这可能与细胞和组织的异质性有关。因此，要探索YTHDF2促进或抑制肿瘤进展的确切条件，需要更全面的研究。其次，探索YTHDF2介导的m6A修饰转录本是阐明其下游调控机制的首要任务。

5 展望

m6A各调节因子之间的相互作用和微环境可能是NAFLD、NASH、HCC等肝脏疾病发生和进展的重要机制，这可为肝脏相关疾病的临床诊断和靶向治疗提供启示。然而，关于肝病更明确的作用机制仍有待阐明，仍需进一步研究m6A修饰失调与肝病之间的联系，仍需进一步研究m6A甲基化的分子机制及其调控因子。

若进一步探究m6A修饰是否能够应用于肝脏相关疾病的治疗，还需要考虑：第一，m6A修饰可能在肝病中发挥双重作用，如在某些情况下具有致癌作用，而在其他情况下具有抑瘤作用。第二，目前关于m6A修饰研究多在细胞或小鼠模型中进行，仍缺乏一定的临床样本。第三，m6A修饰同时影响多个通路中的信号分子，单个m6A调控因子表达的改变可能在多个信号通路的失调中发挥关键作用。