芦笋雄性两性株的研究进展

李 霞，牛晓雪，路 远，包艳存，李保华，牟 萌，杨 林

（潍坊市农业科学院，山东 潍坊 261071）

自然界中高等植物性别的产生是植物在漫长的进化过程中，随着植物的形态、结构和机能适应自然环境变化和发展，特别是繁殖方式的演变而产生的[1]。调查发现，12 000种被子植物中，72%的物种为两性花植物，仅4%的被子植物是严格的雌雄异株，雌雄单性同株的植物占比7%[2]。植物的性别是在个体发育到一定时期才由营养器官的某些细胞分化出生殖器官，雌雄异株植物的性别决定主要分为3大类：主要性染色体（活性Y染色体）决定系统、基因平衡（X染色体/常染色体组比例）决定系统、性别决定基因决定系统[3-4]。植物性别分化的形态特征主要表现在花器构造的差异上，并无明显的第二特征。虽然有些研究者观察到不同性别植株在叶量、叶形、冠形、枝条节间长度等方面有差异，但这往往是个别植物的例子，并非大多数植物的共同特征。从植物进化与发展的过程来看，所有的开花植物都起源于同一雌雄两性花植物祖先。单性花发育的共同特点是原两性花原基的一种有性生殖器官选择败育而造成的[5]。

芦笋（AsparagusofficinalisL.）学名石刁柏，是百合科天门冬属多年生草本植物，以嫩茎供食，是国际市场公认的营养保健蔬菜[6-7]。芦笋属于雌雄异株植物，一般芦笋雌株只开雌花，雄株只开雄花，其性别决定主要体现在雌、雄花器官的形态上。和其他雌雄异株植物一样，不论是在雌株还是雄株中，最初形成的都是两性花，同时具备雄蕊和雌蕊，在发育过程中，雌或雄性器官发生退化，两性花逐渐发育形成单性花[8]。自然条件下芦笋雄性两性株出现的比例仅0%～2%，且自交结实率极低。芦笋性别有3种基因型和4种表现型，4种表现型分别为雌株（mm）、普通雄株（Mm）、超雄株（MM）、雄性两性株（Mm），其中超雄株是有活力的[9-10]，在相同的生长条件下，雄株不仅具有更强的抗病性和生命力，而且品质好，产量比雌株高25%以上，生产上可利用芦笋超雄株与雌株杂交开展全雄育种，即F1代植株全部表现为雄株。目前，获得芦笋超雄株的方法主要有2种：一是雄性两性株自交，在自交后代中筛选超雄株；二是花粉培养诱导芦笋雄核形成双单倍体单株。本研究从芦笋性别分化的遗传基础、雄性两性花的诱导、芦笋雄性两性株的鉴定与应用及展望等方面进行综述分析，以期为将来芦笋的全雄育种工作提供理论基础。

1 芦笋性别分化的遗传基础

芦笋有20条染色体2n=2x=20，染色体分为5条大染色体、1条中型染色体和4条小染色体，除了小染色体3号为亚中着丝粒染色体外，其他的染色体都是中部着丝粒染色体，核型类型属2A型，较不对称，为较原始的类型[11]。芦笋单倍体基因组大小约为1 323 Mb，控制芦笋性别的基因M、m位于L5染色体上，M对m为显性，它控制着芦笋的性别分化，性别机制属于XY异配子型[12-13]，雄性为Mm，雌性为mm，雄性两性株（Mm）会产生两性完全花，引起自花或异花授粉，产生雄雌比例3∶1的后代，符合孟德尔遗传规律，其后代MM基因型个体表现为雄性，称之为超雄株[6]。在L5染色体上，除了性别决定基因外，还存在着一些性别修饰基因，芦笋两性株染色体上存在一种特殊的修饰基因，它能阻碍雌蕊选择性退化，使得不仅雄蕊健全，同时还有健全程度不同的雌蕊、子房和柱头；而普通雄株中没有这种修饰基因，雌蕊退化程度高[14-15]。周劲松等[16]研究发现，从Y染色体上非重组性别决定区域鉴定出雌性抑制基因（SOFF）和雄性特异基因（aspTDF1），它们独立连锁决定芦笋性别，促进天门冬属早期阶段性染色体演化，从分子水平上验证了雌雄异株植物性别决定和性染色体进化。芦笋性别分化是由基因和环境共同决定的发育过程，随着研究的深入和结果的积累，外观表型、内源激素、基因等调控芦笋性别分化的机制、机理将会逐渐清晰，进而通过人工干预调控芦笋的性别分化，服务于芦笋育种。

2 芦笋雄性两性花的诱导研究

有学者在芦笋两性株及两性花的遗传发育机理方面研究认为，芦笋性别分化是选择性诱导或败育的结果[17]。芦笋的性别分化过程，确定两性花向单性花发育的转变时期是花柱开始发育的时刻，雌花的雄蕊退化则是在此之后开始的。性别决定基因在心皮和雌蕊原基出现的早期没有被激活，在其发育后期才发挥作用。研究发现，氮化合物含量、含氮化合物的生物合成代谢与抗氧化酶基因的可变剪接以及抗氧化酶与芦笋两性花、雄花的性别分化密切相关，可通过改变相关基因的表达量、发育阶段基因的可变剪接以及抗氧化酶活性人为调控两性花的形成，从而进一步揭示芦笋两性花与雄花发育的调控机理[18-20]。胡淑明等[21]发现在芦笋雄株和雌株的花器官发育早期，两者都有雄蕊和心皮。当雄花花蕾直径小于2.0 mm时，可诱导两性花的形成。研究发现，通过调控外源激素、多胺和不同生长调节剂的含量，可诱导形成两性花，从而促进雄花中雌蕊的发育，两性花自交结实，获得自交种子，从而获得超雄株[22-23]。陈光宇等[14]研究发现，两性花的发育和结实情况受气候、外部环境、季节的影响。众多研究结果表明，通过调节花的内源物质含量、花蕾的大小、外源激素、不同生长调节剂与气候环境等因素，能诱导两性花的形成，两性花再经多代连续自交获得遗传背景纯合的雄株与雌株，这不仅解决了芦笋种质资源匮乏的问题，同时也为新品种的培育奠定了基础。

Charlesworth[24]研究发现，常染色体上的很多与花发育相关的基因突变，都有可能引起雄性和雌性不育，位于同一染色体上的两个显性互补且紧密连锁的基因突变，可得到2个重要的不育突变体，这2个不育突变体可促使植物由雌雄同体通过雌性两性异体和雄性两性异体进化到雌雄异株。在性染色体的早期进化中，性别决定基因可以通过染色体重组进行重新组合，对芦笋而言2个突变基因之间产生重组抑制，但这个时期的重组抑制较弱，使得YY基因型个体是有活力的。Longo等[25]研究表明，在花发育的早期，3个过氧化物酶同时在雄花和雌花中被检测到，随着雌花中花药发育的停滞，它们迅速在雌花中降解，却依然存在于雄花中。此外，雌、雄花之间蛋白质还存在较大差异，子房在发育过程中存在翻译水平的调控，可能决定子房在雌、雄花中是否可继续发育。

3 芦笋雄性两性株的鉴定

芦笋同其他雌雄异花植物一样，雄花和雌花都是由最初的两性花逐渐发育而来的，在发育早期，性别决定并未发生，此时的花都具有未成熟的两性特征，Caporali等[26]研究表明，当花蕾长度在0.7 mm以下，性别决定实现了两性花向单性花的转变。

3.1 两性株的外部形态鉴定

芦笋是雌雄异株植物，形态学上花器官是辨别芦笋雌雄性的唯一标记。从外部形态上可以通过芦笋的花、果实、种子等器官来判定[14,27]。

3.2 两性株的细胞学鉴定

Ming等[28]指出芦笋性染色体处于进化的早期阶段，含有较原始的X染色体和Y染色体。当性染色体上存在的雄性和雌性控制位点重组受到抑制时，就会形成发育正常的超雄株和两性株。李霞等[29]以两性株根尖染色体和花粉母细胞为研究对象进行了细胞学分析，得到了根尖有丝分裂染色体核型公式、染色体的长度比、核型及减数分裂中期Ⅰ同源染色体详细的配对情况。张元国等[30]对芦笋雄性两性株进行了调查，得到了132株两性株；同时对其镜检技术进行了初步研究。

3.3 两性株的分子鉴定

芦笋两性株与普通雄株表现出了不同的雌蕊结构，两性株的雌蕊要比普通雄株的长，可能在两性株体内另外存在一些性别修饰基因，导致在某种水平上控制着两性花雌蕊的发育，同时控制两性花发育相关基因的表达，且容易受到环境因素的影响[31]。在研究两性花与雄花的碳氮比及氮化合物相关基因可变剪接的差异分析中发现，氮化合物代谢相关基因的可变剪接及较高的表达量和较低的碳氮比有利于两性花雌蕊的发育，从而使得两性花自交或异交结实[18-19]。两性株的常染色体上存放着一个性别调节因子，它控制着两性花的发育，促进两性花的形成。在芦笋两性花与雄花的发育过程中主要以生物合成与物质代谢过程为主，而含氮化合物的生物合成代谢与抗氧化酶基因的可变剪接则在芦笋两性花雌蕊发育中起重要作用，脂质代谢相关基因的可变剪接可能与雄花中雌蕊退化相关。

4 芦笋超雄株的鉴定及应用

4.1 芦笋雄性两性株中超雄株的鉴定研究

目前，全雄育种已成为芦笋育种的重要突破口之一，而获得超雄株是全雄育种的前提，同时超雄株的筛选也是实现芦笋全雄育种的关键。超雄株的形态及生理等各方面特征均与正常雄株相同，即使开花后也仅能判断雄株和雌株，而无法区分雄株和超雄株，目前实际生产中也仅是利用两性株自交或异交，后代通过测交可以筛选出可育的超雄株，但花费时间较长。因此，通过利用与性别决定基因紧密连锁的DNA分子标记进行辅助育种，可提高育种效率，但目前的芦笋分子标记大多是性别分子标记，其应用仅局限于雌、雄性别的鉴别[32]。早在1991年，Bracale等[31]研究发现苹果酸脱氢酶基因是与芦笋性别决定基因有关的分子标记，但该标记与芦笋性别决定基因连锁距离达20 cM，在实际生产中不能应用。Jiang等[33]通过构建芦笋分子连锁图谱，发现14个RAPD标记及4个RFLP 标记定位在芦笋性别决定基因所在的染色体L5上，该项工作为进一步研究芦笋性别连锁标记奠定了基础。国内学者对芦笋性别的研究起步相对较晚，卢龙斗等[34]以UC309为试材，构建了24 bp的特异性引物，在雌性芦笋扩增出1条相应于RAPD标记的雌性特异带，继而转化为SCAR分子标记，可以有效地鉴定芦笋的雌雄。通过与性别连锁的标记来区分芦笋雌雄株，能在早期快速鉴别出测交后代雌雄性别，结合田间测交后代性别表现规律，鉴别、筛选超雄株，为全雄育种提供纯系父本。近年来，芦笋性别连锁分子标记的研究已经取得了较大进展，虽然已经找到一些与芦笋性别决定基因相连锁的分子标记，但是应用到不同群体中难以达到理想的效果，表现出的也只是条带亮度的差异，这种差异很不稳定，甚至有时难以区分，无法直接应用[35-36]。特别是针对雄株和超雄株难以直接区分，李霞等[37]设计开发了性别鉴定的STS双分子标记YSM 和XSM，鉴定出了芦笋的3种性别雌株（mm）、普通雄株（Mm）及超雄株（MM），在自交后代群体中还发现了13株结实的两性株，有利于进一步开展两性株遗传机制的研究。李乐斌等[38]使用标记aspMSE1-xy、aspTDF1-y 和aspWIP2/NTT-x 鉴别芦笋3种不同性别基因型，这为育种者进行芦笋全雄分子标记辅助育种提供了强有力的技术支撑。

4.2 芦笋雄性两性株中超雄株的育种应用

芦笋雌雄异株，基因型高度杂合，遗传育种研究难度大，自然条件下，芦笋的雌雄株比例为1∶1，特别是雄性两性花出现的比例很低、田间筛选困难，使雄性两性花的利用受到很大限制。利用两性花自交可以获得超雄株，使之与优良雌株杂交产生的F1代全部为雄株。两性花自交数代后能使芦笋遗传上的杂合型转变为纯合型。不同纯系间的杂交，有可能产生强优势的杂交品种。已经有学者在芦笋种植群体中发现两性株，通过两性株的连续自交获得超雄株[32,39-41]。

张元国等[42]以优良雌株NX10-1为母本，以优良超雄株SY20-3为父本，培育出全雄品种WF-8。尹俊玉等[43]以美国血统的母本BJ501-35E无性系与超雄父本BJ542-19c无性系组配杂交组合，2010年培育出芦笋全雄品种京绿4号。张岳平等[44]以Atlas中的优良雌株AT3为母本，以全雄品种Backlim中两性株自交S1群体中的优良超雄株B25（04）-15为父本育成全雄F1代杂种井冈111。杨海峰等[45]以993A优良雌株母本，以雄性两性株自交S1代超雄株为父本，选育芦笋全雄品种X0812。

5 展望

为了加快芦笋全雄品种的选育，建议以后主要开展以下工作：（1）加大芦笋种质资源的搜集、利用。作物种质资源是人类社会生存和可持续发展必不可少的财富，是重要的战略资源，当前，我国芦笋种质资源相对匮乏，芦笋种质资源的收集、鉴定及利用，对挖掘优异基因、芦笋育种研究及优良新品种的选育具有重要意义。只有拥有了大量的种质群体，才有可能在群体中选择出雄性两性株，再利用两性株选育出超雄株，进而培育出芦笋全雄品种。（2）利用染色体分带技术、荧光原位杂交技术等对芦笋两性株染色体配对开展精细研究。当前，对芦笋细胞学的研究相对较少[46-47]，且都是利用普通镜检技术，开展了芦笋染色体有丝分裂的核型分析及减数分裂配对分析，仅仅靠这些染色体外部形态结构很难对各条染色体进行精密的分析。随着染色体分带技术和原位杂交技术等的发展，对芦笋染色体处理分析，根据各条染色体的不同带型，比较其数量和位置的差别，就能够较精确地对染色体识别分析，同时利用原位杂交信号精确地将基因序列定位在染色体上，明确特定基因序列与染色体上端粒、着丝粒间的相互关系[48]。（3）利用高通量分子测序技术开展芦笋雄性两性株遗传机理的研究。与传统分子标记相比，高通量分子标记测序技术为作物遗传育种提供了捷径，缩短了育种周期，促进了育种材料优良基因的挖掘和有效聚合，对作物遗传育种具有深远的影响。高通量分子标记测序技术在芦笋两性株遗传研究方面将会起到重要的作用。（4）研究表观遗传修饰对芦笋性别决定和性别分化的调控如何稳定遗传给子代。近年来，多种植物的生命活动和表观遗传修饰的联系逐渐被发掘，从而揭示了环境因子和植物相互作用的复杂机制。不同类型表观遗传修饰的产生和维持需要依靠特定的酶来完成；同时，各修饰间存在密切的联系，调控机制复杂且受到环境影响，这也使得表观遗传修饰能够对植物基因的表达进行较为精细的调控，使植物体对环境胁迫做出一定的反应，并可将这种反应在一定程度上遗传给后代[49]。在对芦笋两性株的研究中发现，两性株的出现与其生长过程中的温度、湿度、光照等外部环境有关联，将来可以通过表观遗传修饰对芦笋性别决定和分化进行精细调控，从而使两性、超雄性稳定地遗传给后代，为选育性状稳定一致的全雄品种奠定基础。