月苄三甲氯铵和过硫酸钾复合盐对犬瘟热病毒和犬细小病毒消毒效果的比较

谭 越，孙少辉，白东宁，张 刚，刘 姣，马妮妮，万 进，戴银娣，王 聪，高钟镐

（1. 青岛农业大学动物医学院，山东省新兽药创制协同创新中心，山东青岛 266109；2. 中牧实业股份有限公司，北京 100070；3.西安市动物疫病预防控制中心，陕西西安 716100；4. 中牧实业股份有限公司黄冈动物药品厂，湖北黄冈 438021；5. 中牧南京动物药业有限公司，江苏南京 210012；6. 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京 100050）

犬瘟热和犬细小病毒病对犬类健康造成严重威胁。犬瘟热的发病率和死亡率高达80%以上，其病原犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）是一种带有囊膜的单链负链RNA病毒，对高温、紫外线及有机溶剂较敏感，对酸碱抵抗力不强[1-2]，易与细菌和其他病毒发生继发或混合感染[3]。犬细小病毒病病原犬细小病毒（canine parvovirus，CPV）是一种无囊膜的单链DNA病毒，其对物理消毒和化学消毒方式具有较强的抵抗力，在低温下仍具有侵袭性[4]。对于犬瘟热和犬细小病毒病的防治，不仅要做好免疫预防，也要加强饲养管理，搞好犬舍清洁卫生[5-6]，及时隔离病犬并加强环境消毒。

月苄三甲氯铵消毒剂是一种阳离子表面活性剂，具有抗菌和抗病毒活性，它通过聚集在包膜病毒表面来改变病毒生物膜的通透性和完整性，继而渗透进病毒体内，使其蛋白质变性[7-9]。过硫酸氢钾复合盐可在水中进行链式反应，产生次氯酸、新生态氧等，通过氯化和氧化病原体，干扰病原体DNA或RNA合成，使其蛋白质变性，进而干扰病原体酶系统，影响其代谢；此外过硫酸氢钾复合盐还会增加细胞膜的通透性，造成酶和营养物质流失，使病原体溶解破裂，进而杀灭病原体[10-12]。本试验使用这两种消毒剂对CDV、CPV进行体外灭活试验，比较不同消毒剂的灭活作用，从而客观反映这两种消毒剂的实际临床消毒效果，以期为犬病毒性疾病防控中消毒剂的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

消毒剂1（10%月苄三甲氯铵溶液+有机微量元素）、消毒剂2（月苄三甲氯铵溶液）和消毒剂3（过硫酸氢钾复合盐消毒粉），均为国内市售产品。试验所用病毒株为CDV QN-1株、CPV QN株，细胞为Vero细胞和F81细胞，均由青岛农业大学预防兽医学重点实验室提供。DMEM细胞培养液，购自美国Cytiva公司；Trypsin-EDTA，购自美国Gibco公司；胎牛血清，购自美国BI公司；D-PBS，购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 病毒扩增及悬液制备 CDV采用异步接毒法，待细胞长至单层后弃掉培养基，将病毒接入，37 ℃吸附1 h后更换维持液继续培养。具体方法如下：待细胞瓶内Vero细胞生长密度达到70%～80%时，弃掉细胞培养基上清并用PBS冲洗3次，加入适量CDV，在37 ℃ 5% CO2培养箱中孵育2 h后弃掉病毒液，用含2% FBS的DMEM培养液维持培养，每隔24 h观察细胞病变（CPE），待80%～90%的细胞出现CPE时收毒，收毒时将细胞瓶置于-80 ℃冰箱反复冻融3次，1 200 r/min离心5 min，收集上清，将其分装于1.5 mL保存管，于-80 ℃冰箱中保存备用。CPV采用同步接毒法，待细胞长至单层后弃掉培养基，将病毒接入，同时加入维持培养基，放入培养箱中培养，在此期间不更换培养基。具体方法如下：待T75细胞培养瓶中F81细胞长成单层时，弃掉原培养基，用PBS冲洗3遍，吸取1 mL CPV加至细胞瓶中，再向细胞瓶中加入11 mL含2%胎牛血清的DMEM细胞培养液，放于37 ℃ 5% CO2的培养箱中培养，待80%～90%的细胞出现CPE时收毒，收毒步骤同CDV。

1.2.2 病毒滴度测定 分别用Vero细胞和F81细胞铺板，待T25培养瓶细胞生长密度达到80%～90%时，用胰酶消化后冲悬于细胞瓶中，计算细胞个数，以5×104个接种于96孔板中，置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养，待细胞生长密度达到80%～90%时进行后续试验。稀释CDV QN-1株和CPV QN株，待96孔细胞板内细胞长至单层后，弃掉原培养液，用PBS冲洗2～3遍，用含2% FBS的DMEM培养液将CDV和CPV进行10倍倍比稀释（10-1～10-10），按每孔100 μL接种于96孔细胞板中（CDV接种于铺满Vero细胞的96孔板上，CPV接种于铺满F81细胞的96孔板上），做8个重复，同时设置空白对照和阳性对照，待出现CPE后观察记录结果，用Reed-Muench法计算病毒的TCID50。

1.2.3 最高病毒滴度接种量确定 当细胞生长密度达到80%～90%时，将CDV和CPV病毒液按照细胞培养体积0.02%、0.10%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%的比例分别接种Vero和F81细胞[13]，然后将其置于细胞培养箱中培养，待CPE达到80%～90%时收毒。将收获的病毒液按照1.2.2中的方法分别测定TCID50，比较不同接毒量的TCID50，确定能产生最高病毒滴度的接毒量。

1.2.4 消毒剂毒性测定 用细胞维持液把消毒剂稀释100倍，分别将已稀释的消毒剂再次进行倍比稀释（10-1～10-3），接种于96孔板中，设置重复以及阴性对照，置于培养箱中培养，24 h后在显微镜下观察不会对细胞生长产生影响的消毒剂使用浓度。

1.2.5 消毒剂的体外消杀作用 用灭菌水将消毒剂进行100倍稀释，选用最高病毒滴度的CDV和CPV毒株，分别将消毒剂与病毒等比例混合于平皿中，室温作用0、1、3、10、24 h后接种细胞，根据CPE计算病毒滴度和杀灭指数。杀灭指数=消毒剂与病毒作用后的TCID50/病毒阳性TCID50[13]。

2 结果与分析

2.1 病毒感染细胞观察

从图1可观察到CDV感染Vero细胞不同时间形态的改变：接毒24 h时，少量细胞变圆，缩小；48 h时，大部分细胞变圆，出现明显CPE；72 h时，细胞大量脱落，呈拉丝状悬浮在细胞液中。

图1 CDV感染Vero细胞观察结果

从图2能观察到CPV感染F81细胞不同时间形态的改变：接毒24 h时，CPE不显著；48 h时80%以上细胞形态发生变化，细胞变得细长，CPE显著；72 h细胞出现拉丝脱落，飘浮在细胞培养基中。

图2 CPV感染F81细胞观察结果

2.2 病毒滴度测定

根据表1～2数据，用Reed-Muench法计算出CDV和CPV的TCID50分别为10-5.5/0.1 mL和10-5.8/0.1 mL。

表1 CDV滴度的测定结果

表2 CPV滴度的测定结果

2.3 最高病毒滴度接种量确定

接毒结果（图3～4）显示：CDV接毒量占细胞培养基总量的2%时，培养滴度最高为10-5.5/0.1 mL；CPV接毒量占细胞培养基总量的1%时，培养滴度最高为10-5.8/0.1 mL。

图3 CDV异步接毒结果

图4 CPV同步接毒结果

2.4 消毒剂毒性测定

通过显微镜观察到，3种消毒剂10-1稀释均对Vero细胞和F81细胞有较大的毒性作用，因此在10-1稀释的基础上再次进行10倍倍比稀释。结果（图5～6）显示：当10-1稀释时，细胞死亡；当10-2和10-3稀释时，细胞形态正常，生长状态良好。因此，计算消毒剂与病毒作用后的TCID50时，从10-2稀释时开始计算CPE孔数。

图5 3种消毒剂对Vero细胞的毒性观察结果

图6 3种消毒剂对F81细胞的毒性观察结果

2.5 消毒剂杀灭效果

2.5.1 消毒剂与病毒作用后的TCID50选用最高病毒含量的CDV（TCID50= 10-5.5/0.1 mL）和CPV（TCID50 = 10-5.8/0.1 mL）病毒原液，分别与100倍稀释后的3种消毒剂等比例混合于平皿中，室温作用不同时间后接种细胞，记录出现CPE的孔数。计数时根据2.4中的结果舍弃10-1稀释，从10-2稀释开始计算CPE孔数。消毒剂与病毒作用结果（表3～4）显示：在室温下3种消毒剂与CDV作用24 h就可将其完全灭活，而与CPV作用24 h未能将其彻底灭活。

表3 消毒剂与CDV作用后结果（TCID50）

表4 消毒剂与CPV作用后结果（TCID50）

2.5.2 消毒剂杀灭指数 3种消毒剂与CDV（TCID50= 10-5.5/0.1 mL）、CPV（TCID50= 10-5.8/0.1 mL）作用后的杀灭指数如表5～6所示。可以看出：3种消毒剂中，消毒剂3对CDV和CPV的杀灭作用最强，其次是消毒剂1，最后为消毒剂2。

表5 消毒剂与CDV作用杀灭指数

表6 消毒剂与CPV作用的杀灭指数

3 讨论

随着宠物行业的不断发展，一些传染性疾病如犬瘟热、犬细小病毒病等的发病率和死亡率不断上升，对于此类病毒病的防控，消毒剂起到了尤为重要的作用，通过正确使用消毒剂可以切断病原传播途径，控制传染病流行，从源头上阻断病原微生物传播[14-15]。虽然目前市场上消毒剂种类繁多，但它们大多以灭菌效果作为评价标准，对病毒的灭活效果研究相对较少。本试验结果在一定程度上反映了月苄三甲氯铵和过硫酸钾复合盐对犬类病毒性疾病的临床应用效果，为宠物行业消毒剂的选择提供了参考。

病毒的抵抗力介于细菌和芽孢体之间，而囊膜病毒和非囊膜病毒在体外灭活难易程度上有明显差异。通过本试验可以看出，月苄三甲氯铵和过硫酸钾复合盐消毒剂对CDV的杀灭效果更好，以此验证了亲脂性消毒剂对囊膜病毒更有效。张浩等[16]以猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗和伪狂犬病病毒活疫苗作为RNA/DNA病毒模型，检测了过硫酸钾复合盐消毒剂对两种病毒的降解效果，发现过硫酸钾复合盐消毒剂能100%降解RNA和DNA病毒核酸。本试验发现，过硫酸钾复合盐消毒剂（消毒剂3）与CDV（有囊膜RNA病毒）作用24 h可将其完全杀灭，但却不能完全杀灭CPV（无囊膜DNA病毒），造成此差异的原因可能与不同毒株毒力的强弱以及病毒结构有关。CPV直径小，无囊膜包被，但有蛋白质衣壳，因而对消毒剂有较高抵抗力，一般消毒剂很难将其杀灭。然而有研究[17]发现与次氯酸作用15 min可以使CPV在细胞上完全丧失感染性。因此，在选择消毒剂时要充分考虑病毒性质及结构。目前月苄三甲氯铵消毒剂主要应用于细菌病防控。邓同炜等[18]的研究表明，月苄三甲氯铵消毒剂对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的杀灭率均可达到100%。然而此类消毒剂在犬类病原微生物感染的防控过程中应用较少。本试验发现，月苄三甲氯铵消毒剂对犬类病毒有一定的灭活效果，且安全性高，因此在临床中也会有一定的应用价值。从CDV、CPV与消毒剂体外作用时间上看，延长与消毒剂的作用时间可以增强消毒效果；从生物安全角度出发，为避免耐药性产生，应定期更换消毒剂，在消毒剂选择上既要考虑其消毒效果，也要考虑其对动物的伤害，在此基础还需要考虑外界环境因素对消毒剂的影响，以充分发挥其消毒效果。