重组酶扩增技术概述及应用研究进展

陈兴浩，李 鑫，沈海潇，张校培，3，徐丽娜，张鹤平，葛菲菲，杨显超，刘 健，白艺兰，王 建，杨德全，赵洪进

（1. 河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056038；2. 上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103；3. 安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230031）

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是到目前为止在分子检测方面应用最广泛的病原体检测技术，具有特异性强、灵敏度高、核酸浓度要求低等优点，可对病原进行定性与定量检测，但其对设备要求高，操作较为繁琐，目前只适用于实验室检测，无法进行现场快速核酸检测。而等温扩增技术的出现打破了PCR无法进行现场快速核酸检测的现状，与其他核酸扩增技术相比，具有特异性强、灵敏度高、反应时间短、操作简单、对仪器设备要求低、无需热循环等优势[1]。对动物疫病进行现场快速核酸检测，及时诊断动物疫病，对于动物疫病防控有重大意义。目前常用的等温扩增技术为重组酶扩增技术，其中包括重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）、酶促重组等温扩增技术（enzymatic recombinase amplification，ERA）、重组酶介导等温扩增技术（recombinase aided amplification，RAA）、多酶恒温核酸快速扩增技术（multienzyme isothermal rapid amplification，MIRA）。本文从原理及应用等方面，对这几种重组酶扩增技术进行综述，以期为重组酶扩增技术的进一步发展与应用提供参考。

1 重组酶等温扩增技术概述

1.1 技术原理

RPA是以T4噬菌体核酸复制机制为原理，通过重组酶蛋白（uvsX）、单链结合蛋白（gp32）和DNA聚合酶（Bsu）的作用，在体外完成核酸的恒温扩增反应[2]。RPA反应原理：第一，在腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）参与下，重组酶分别与上下游引物结合形成重组酶-引物复合体；第二，该复合体扫描双链DNA模板，并识别与引物同源的靶序列；第三，定位至同源靶序列后，重组酶解开双链结构，并促使引物与模板进行链交换，形成D环结构，同时单链结合蛋白结合到被置换出的单链DNA上，稳定D环结构；第四，ATP水解供应能量，改变重组酶-引物复合体构象，重组酶解离暴露出引物的3'端，DNA聚合酶结合至引物上，启动DNA扩增；第五，DNA聚合酶延伸过程中置换出的DNA单链与单链结合蛋白结合，稳定单链结构，上下游引物同步反应，最终形成一个完整的扩增子。ERA、RAA、MIRA的扩增原理与RPA基本相似，其创新点分别为：ERA反应所依赖的重组酶来源于低温噬菌体，并且对特定位点氨基酸进行替换，具有良好的扩增速度和特异性[3]；RAA反应所依赖的重组酶来源于细菌或真菌，具有更好的稳定性[4]；MIRA对酶进行了定点改造与修饰，使其酶体系效率更高，并对辅因子种类与浓度进行了优化，使其抗干扰能力与稳定性更强。如果在RPA、ERA、RAA、MIRA体系中加入逆转录酶，还可用于RNA检测。另外，在RPA、ERA、RAA、MIRA体系中加入荧光探针和核酸酶，便可进行实时检测；若结合侧向层析技术（LFD），则可实现可视化检测[5]。

1.2 技术优点

重组酶等温扩增技术反应迅速，30 min内可得出结果[6]；操作简便，无需复杂专业的实验室，非专业人员亦可完成样本检测；灵敏度可达100～101copies/反应，引物结合荧光探针，特异性高；扩增期间不需要复杂仪器，反应温度为25～42 ℃（表1）[7]；后续可以开发为荧光检测试验、侧流层析试纸条等快检手段，可满足不具备分子检测技术的现场对动物疫病进行快速核酸检测的需求。

表1 重组酶等温扩增技术总结及简称

1.3 技术难点

琼脂糖凝胶电泳成像在检测前需要进行产物纯化；没有PCR的热循环来避免引物之间的结合，恒定温度下反应难以避免部分非特异性扩增；扩增引物长度均要求30～35 bp，引物太短会影响特异性、灵敏度和扩增速度，引物设计有难度[8]；RPA是英国TwistDx公司开发的技术，其成本极高，供货周期长，在国内很难实现大面积应用和量产；ERA、RAA、MIRA均为国内开发的技术，具有自主专利，不必担心在后期成品研发中触及专利违规情况，在今后国内乃至国际市场的竞争中具有显著优势，可以稳定大批量生产，但市场认知度还比较低，需要进一步积累数据，引物设计上延续了RPA或RAA等技术的特点，需要较长的引物或探针序列，不利于当下PCR用户的快速切换；4种技术灵敏度较高，因而容易受到气溶胶污染而导致假阳性出现[9]。

2 重组酶等温扩增技术应用研究进展

2.1 病毒检测

Liu等[10]建立了基于实时荧光检测的牛A群轮状病毒（bovine rotavirus A，BRVA）RT-RPA检测方法（real-time RT-RPA）和结合侧流层析的RT-RPA检测方法（LFD RT-RPA）。这两种检测方法均对BRVA具有高特异性，与其他引起牛腹泻的病原体无交叉反应。以BRVA标准RNA为模板，real-time RT-RPA和LFD RT-RPA的检出限分别为1.4×102和1.4×101copies/μL。与实时荧光定量PCR相比，real-time RT-RPA和LFD RT-RPA的诊断特异性均为100%，诊断敏感性分别为98.39%和100%，kappa系数分别为0.985和1.000。

Wang等[11]建立了一种检测H5亚型禽流感病毒（H5 subtype avian influenza virus）的逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）方法，其与新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）无交叉反应，灵敏度为103copies/μL，特异性为100%。与已有的RT-qPCR方法比较，RT-RAA方法在420份禽类临床样本中的kappa系数为0.983，禽临床样本检测灵敏度为97.26%，特异性为100%。

Wei等[12]成功构建了用于猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）检测的ERA-CRISPR/Cas12a方法，其检出限为3.75×102copies/μL，与其他猪病病毒不发生交叉反应，与qPCR数据的符合率为100%。

Chen等[13]采用等温扩增-多酶恒温快速扩增技术（RT-MIRA）快速检测严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2），其检测ORF1ab基因的95%检出限为49.5 copies/mL，N基因的95%检出限为48.8 copies/mL，与其他呼吸道病原体，如严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合症冠状病毒（MERS-CoV）、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人腺病毒、呼吸道合胞病毒、人副流感病毒没有交叉反应。对243份核酸样本分别进行RT-MIRA和qPCR检测，发现阳性预测值和阴性预测值均为100%；与qPCR比较，两种方法的kappa系数为1.00。

此外许多研究者基于这几种扩增技术对其他病毒均建立了检测方法（表2）。

表2 重组酶扩增技术在病毒检测方面的应用

2.2 细菌检测

Gumaa等[19]建立了针对布鲁氏菌bp26基因IS711插入序列的结合侧流层析试纸（LFD-RPAIS711）的SYBR-Green重组酶聚合酶扩增技术，用于检测来自不同类型家畜的布鲁氏菌。采用实时荧光定量PCR（real-time PCR）、虎红平板凝集试验（RBPT）对两种RPA的敏感性和特异性进行比较。结果显示：real-time RPA和LFD RPA的检出限分别为4 copies/μL和6 copies/μL；两种方法分别在40 ℃和37 ℃条件下，20 min内检测到带有目标序列的6个菌落形成单位（CFU），与real-time PCR和PCR的结果没有显著差异；两种方法均与流产衣原体、刚地弓形虫、鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌无交叉反应。

杜秋明等[20]建立了用于检测多杀性巴氏杆菌的RAA荧光检测方法。该方法在39 ℃恒温条件下20 min内即可特异性检出多杀性巴氏杆菌，与鸭疫里默氏杆菌、副猪嗜血杆菌、支原体、链球菌、大肠杆菌、附红细胞体、新孢子虫无交叉反应，最低检出限为10 copies/μL，组内和组间重复性试验的变异系数均小于10%。用该方法对45份临床样本进行检测，发现阳性率为33.33%，与荧光定量PCR方法检测结果一致。

王淑娟等[21]采用MIRA荧光法，结合金属有机骨架免疫磁珠富集功能，开发了大肠杆菌O157:H7快速富集和检测方法。该方法检测大肠杆菌O157:H7菌体的检测限为1.18×105CFU/mL，菌体DNA检测限为9 pg/μL，检测过程可在20 min内完成。47株菌（24株目标菌和23株非目标菌）的特异性验证结果与real-time PCR一致。

此外有许多研究者基于这几种扩增技术建立了其他细菌的检测方法（表3）。

表3 重组酶等温扩增技术在细菌检测方面的应用

2.3 寄生虫检测

Onchan等[26]建立了一种基于18S rRNA区域的RPA-LFD检测方法，用于快速准确检测犬血液样本中的巴贝斯虫。该方法对犬巴贝斯虫具有特异性，与其他寄生虫无交叉反应，在40 ℃条件下用时至少10 min，检测限至少为22.5 copies/μL。利用该方法共检测了30例临床样本，并与常规PCR（cPCR）进行了比较，结果用RPA-LFD检出阳性8例（26.67%），cPCR检出阳性7例，RPA-LFD和cPCR的kappa系数＞0.9，检测结果吻合度较高。

叶钰滢等[27]建立了一种用于快速检测日本血吸虫特异性基因片段的重组酶介导核酸等温扩增核酸试纸条检测方法。以重组质粒为模板，建立的日本血吸虫特异性基因片段核酸试纸条检测方法最低检测限为10 copies/μL；以成虫基因组DNA为模板，最低检测限为1 pg/µL。该方法检测华支睾吸虫、曼氏血吸虫、十二指肠钩口线虫、埃及血吸虫、巴贝斯虫和卫氏并殖吸虫基因组DNA结果均为阴性。

2.4 其他微生物检测

Xia等[28]采用RAA和LFD相结合的方法，建立了一种简单、快速、直观的滑膜支原体（MS）RAA-LFD检测方法。在38 ℃恒温条件下，RAA可在20 min内扩增出目的基因，5 min内LFD可观察到扩增产物，与鸡败血支原体（MG）、多杀性巴氏杆菌（P.multocida）、大肠杆菌（E.coli）、NDV、IBV、传染性法氏囊病病毒（IBDV）和禽呼肠孤病毒（ARV）没有交叉反应。RAA-LFD法灵敏度高，检测限为10 copies/μL，与常规PCR检测结果符合率为95.3%，与实时定量PCR（qPCR）检测结果符合率为98.4%。

Zhao等[29]建立了一种特异性检测牛支原体DNA的RPA-LFD方法。该方法在39 ℃条件下30 min内成功检测到牛支原体DNA，每次反应检测限为20 copies。与qPCR方法比较，该方法特异性强，与其他牛病原体无交叉反应；敏感性为99.00%，特异性为95.61%，kappa系数为0.902。

Jiao等[30]建立了一种检测鹦鹉热衣原体的RAALFD方法，其检测灵敏度低至1×100copies/μL，与其他病原体无交叉反应，在感染鹦鹉热衣原体1 d后的小鼠粪便样品中均检出阳性。

3 展望

目前，等温扩增技术虽然存在着市场认可度低、通量低、无统一标准的难点，但相较于传统的核酸扩增技术来说，其具有操作简单快速、设备及学习成本低等优势，完全符合简单快速、低成本，不需专业实验人员，使用便携式仪器的现场快速检测需求。等温扩增技术仍需改进，比如在试剂稳定性、通量等方面。随着科技的不断进步，等温扩增技术也会愈发成熟，将会真正实现便携式现场快速检测，更好地服务于动植物检疫乃至人类疫病防控。