不同分子生物学方法在H5亚型禽流感病毒检测中的应用比较

尚佳静，罗 娟，于晓慧，房立春，亓丽红，孟 鸽，封莹洁，蒋文明，刘华雷，刘冠慧，李 阳

（1. 河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056038；2. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南 250199）

禽流感（avian influenza，AI）是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一类急性、热性、高度接触性疾病。AIV属于正黏病毒科，为单股负链RNA病毒，有囊膜，主要通过呼吸道、消化道或者直接接触传播[1]。根据HA蛋白差异，AIV可分为16个血清型（H1～16），其中H5-AIV被归类于高致病性禽流感病毒（high pathogenic avian influenza virus，HPAIV）[2]。高致病性禽流感（high pathogenic avian influenza，HPAI）是世界动物卫生组织（World Organisation for Animal Health，WOAH）规定的法定报告疫病，我国将其列为一类动物疫病。2019—2022年，H5-AIV一直在欧洲、非洲和亚洲的禽类中流行，使全球禽类病例从3 430例增加至25万例[3-5]。据农业农村部官方网站报道，2022年全球60多个国家和地区的家禽和野鸟中暴发了H5-AI疫情，超1.31亿只家禽死亡或被扑杀；2023年以来，H5-AIV在欧洲、美洲、亚洲和非洲的40多个国家和地区传播，导致超过3 700万只家禽死亡或被扑杀。此外，哺乳动物（如貂、水獭、狐狸和海狮）感染H5-AIV的病例也不断出现[6-8]。尽管AIV通常在鸟类中传播，但哺乳动物感染H5N1-AIV的病例也在持续增加。在生物学上，哺乳动物比鸟类更接近人类，这更加引发了人们关于病毒可能适应新变化，从而对人类感染性更强甚至引发全球大流行的担忧。因此，建立快速且准确可靠的检测方法对H5-AI防控具有重要意义。

目前，实验室常见的H5-AIV检测方法主要有反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）[9]、荧光定量PCR（RT-qPCR）[10]、病毒分离[11]、血凝和血凝抑制（HA/HI）试验等，为H5-AI疫情防控提供了有力支撑。但这些方法因操作复杂、耗时长、对场地要求高等局限性难以被广泛应用。重组酶辅助扩增技术（RAA）与成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins，CRISPR/Cas）是近年来新兴的核酸检测技术，可以在短时间内实现对病原的快速检测[12-13]。本研究使用RT-PCR、RT-qPCR、反转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）、RT-RAA结合侧流层析试纸条（RTRAA-LFD）、RT-RAA-簇状规则间隔短回文重复序列及其相关蛋白结合侧流层析试纸条（RT-RAACRISPR Cas13a-LFD）等5种检测技术对构建的H5-AIV cRNA标准品和临床样本进行检测，旨在对目前已建立的5种H5-AIV检测方法进行比较分析，以期为H5-AIV感染的检测与防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及临床样本 本研究所用的H5-AIV毒株，均由中国动物卫生与流行病学中心禽病监测室保存备用；80份临床家禽肛拭子、咽拭子样本，采集自山东、湖南、广东等地。

1.1.2 仪器与耗材 荧光定量PCR仪，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；恒温金属浴，购自莫纳生物科技有限公司；振荡混匀仪、恒温核酸扩增仪，购自江苏奇天生物科技有限公司；琼脂糖、TAE缓冲液，购自青岛睿博兴科生物技术有限公司；RT-RAA、RAA恒温扩增试剂盒（荧光型）、一次性核酸检测试纸条（显线法/消线法），购自杭州众测生物科技有限公司；RNA/DNA核酸提取试剂盒，购自济凡生物科技（青岛）有限公司；pEASY®-T1 Cloning Kit，购自北京全式金生物技术股份有限公司；胶回收试剂盒，购自TaKaRa公司；质粒小提试剂盒，购自天根生化科技有限公司；HiScript II One Step RT-PCR Kit、RNase抑制剂，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Evo M-MLV一步法RT-qPCR检测试剂盒Ⅱ（探针法），购自艾科瑞生物科技有限公司；LWaCas13a，购自金斯瑞生物科技股份有限公司；T7体外转录试剂盒、T7 RNA聚合酶、NTP，购自NEB公司；MgCl2、HEPES，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 引物及探针序列 本研究所用引物及探针序列见表1。

表1 引物和探针名称及序列

1.2 病毒核酸提取

根据济凡生物科技（青岛）有限公司RNA/DNA通用核酸提取试剂盒说明书，进行H5-AIV及临床样本核酸提取。

1.3 cRNA标准品制备

以H5-AIV核酸为模板，使用HA-F/HA-R引物进行RT-PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定条带大小无误后进行回收纯化；将纯化产物连接至T载体，然后转化至DH5α感受态细胞中，经热激、冰浴后，向其中加入LB液体培养基37 ℃培养1 h；将菌液涂布于含有Amp抗性的LB固体培养基，挑取单菌落于LB液体培养基中37 ℃培养4 h；进行菌落PCR，将鉴定为阳性的菌液送至睿博兴科生物技术有限公司测序；提取质粒进行酶切鉴定，使用DNA回收试剂盒对目的基因回收，再经体外转录试剂盒进行体外转录获得cRNA，最后以Rneasy MiNi Kit纯化，测定纯化后的cRNA标准品质量浓度并置于-80 ℃保存。

1.4 RT-PCR检测

分别以不同拷贝数浓度梯度的cRNA标准品为模板，以RT-PCR-F/RT-PCR-R为引物，按照RT-PCR试剂盒说明书配制反应体系。反应程序：50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；90 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 5 min。扩增结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳，于照胶仪中观察结果。

1.5 RT-qPCR检测

分别以不同拷贝数浓度梯度的cRNA标准品为模板，以RT-qPCR-F/RT-qPCR-R为引物，以RTqPCR-P为探针，按照一步法RT-qPCR试剂盒说明书配制反应体系。反应程序：42 ℃ 5 min，95 ℃30 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，35个循环。

1.6 RT-RAA检测

分别以不同拷贝数浓度梯度的cRNA标准品为模板，以RT-RAA-F/RT-RAA-R为引物，以RTRAA-P为探针，按照RT-RAA恒温扩增试剂盒（荧光型）说明书配制反应体系。配制完成后将反应单元放于振荡混匀仪，37 ℃反应5 min，然后转移至恒温核酸扩增仪进行扩增，37 ℃反应20 min，记录检测结果。

1.7 RT-RAA-LFD检测

分别以不同拷贝数浓度梯度的cRNA标准品为模板，以RT-RAA-LFD-F/RT-RAA-LFD-R为引物，以RT-RAA-LFD-P为探针，按照RT-RAA恒温扩增试剂盒（荧光型）说明书配制反应体系，将不含B Buffer的反应混合溶液加入试剂盒反应干粉中，随后在反应管盖加入2.5 μL B Buffer，轻轻混匀后将反应单元置于恒温金属浴中，37 ℃反应15 min。待扩增反应结束后，吸取10.0 μL扩增产物加入含有60 μL PBS缓冲液的离心管中，将试纸条放入离心管，5 min内观察结果并记录。

1.8 RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD检测

分别以不同拷贝数浓度梯度的cRNA标准品为模板，以Cas13a-F/Cas13a-R为引物，按照RTRAA恒温扩增试剂盒（基础法）说明书配制RTRAA反应体系进行扩增。待扩增结束后，取5 μL扩增产物加入到45 μL CRISPR Cas13a检测体系中，体系如表2所示。

表2 RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD反应体系

将上述体系充分混匀后，立即放入恒温金属浴中，37 ℃反应20 min（注意避光），反应结束后将反应体系放入照胶仪中观察结果并拍照。

1.9 临床样本检测及数据处理

利用上述5种方法对80份临床样本进行检测，对检测结果应用SPSS软件分析符合率和Kappa值。符合率即不同方法检测结果与RT-qPCR结果相同数占样本总数的比例；Kappa值为一致性统计指标，Kappa值≥0.75说明两种方法检测结果具有良好一致性，0.4≤Kappa值＜0.75说明一致性一般，Kappa值＜0.4说明一致性较差。

2 结果

2.1 灵敏度比较

2.1.1 RT-PCR检测 测得cRNA标准品质量浓度为39.4 ng/μL，经换算，拷贝数浓度为4.1×1010copies/μL，将其稀释为1×1010copies/μL，经10倍倍比稀释后，以108～101copies/μL的cRNA标准品为模板，进行RT-PCR检测。结果（图1）显示，RT-PCR方法可检测到100 copies/μL的H5-AIV cRNA标准品。

图1 RT-PCR方法灵敏度试验结果

2.1.2 RT-qPCR检测 以103～10-1copies/μL的cRNA标准品为模板，进行RT-qPCR扩增，评估该方法的灵敏度。结果（图2）显示，RT-qPCR方法可检测到10-1copies/μL的cRNA标准品。

图2 RT-qPCR方法灵敏度试验结果

2.1.3 RT-RAA检测 以103～10-1copies/μL的cRNA标准品为模板，进行RT-RAA检测。结果（图3）显示，RT-RAA方法可检测到1 copies/μL的cRNA标准品。

图3 RT-RAA方法灵敏度试验结果

2.1.4 RT-RAA-LFD检测 以105～10-1copies/μL的cRNA标准品为模板，进行RT-RAA-LFD检测。结果（图4）显示，RT-RAA-LFD方法可检测到1 copies/μL的cRNA标准品。

图4 RT-RAA-LFD方法灵敏度试验结果

2.1.5 RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD检测以106～10-2copies/μL的cRNA标准品为模板，以ddH2O为阴性对照，进行RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD检测。结果（图5）显示，RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD方法可检测到10-1copies/μL的cRNA标准品。

图5 RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD方法灵敏度试验结果

2.2 临床应用比较

利用RT-qPCR方法对本研究中所收集的80份临床样品进行检测，结果共鉴定出38份H5-AIV阳性样本，42份H5-AIV阴性样本。随后使用4种方法进行检测，并对检测结果进行分析比较。结果（表3）显示：RT-PCR、RT-RAA、RT-RAALFD、RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD与RT-qPCR结果的符合率分别85.00%、93.75%、88.75%、91.25%，与RT-qPCR相比，上述4种方法的Kappa值分别为0.74、0.87、0.77、0.82，提示RT-PCR一致性符合率最低。

表3 不同检测方法与RT-qPCR在临床样本检测的比较

3 讨论

由H5-AIV引起的HPAI不仅严重影响着我国养禽业的发展，还对公共卫生安全造成了威胁。我国是养殖业第一大国，鉴于动物和人类H5-AIV感染病例的不断出现，加强对其检测，防止进一步传播至关重要。

当前，针对H5-AIV常用的实验室检测方法主要有RT-PCR、病毒分离及RT-qPCR。RT-PCR已被广泛用于AIV检测，相较于RT-qPCR，其成本较低，便于操作，但扩增产物需进行琼脂糖凝胶电泳，这增加了检测时间，且显影剂对人体伤害较大[14]；RT-qPCR虽灵敏度高，结果准确，但由于荧光定量PCR仪及试剂昂贵，且需专业人员进行操作等问题，无法满足现场快速检测的需求。应在生物安全三级实验室（BSL-3）或更高等级的设施中处理HPAIV，这使得试验开展具有一定的局限性，成本较高，增加了试验难度[15]。恒温核酸扩增技术与CRISPR技术具有特异性好，灵敏度高的特点，同时结合侧流层析试纸条可实现检测结果的可视化。本研究选用实验室常规RT-PCR、RT-qPCR方法及新兴RAA与CRISPR技术，对H5-AIV检测的灵敏度和临床应用效果进行了比较分析。结果显示：RT-qPCR方法灵敏度更高，但与RT-PCR方法一样检测时间需1～2 h，不仅耗时长还需精密仪器及专业人员操作，无法满足现场快速检测需求；RT-RAA、RT-RAA-LFD与RTRAA-CRISPR Cas13a-LFD均可在恒温条件下进行病毒核酸扩增，且RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD与WOAH推荐的RT-qPCR检测灵敏度一致，临床检测符合率较高，是值得推广的一项技术。但本研究中RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD扩增为两步法，即RT-RAA扩增一步，CRISPR一步，存在造成气溶胶污染的风险。因此，为进一步缩短检测时间并降低气溶胶污染风险，应将RT-RAA扩增与CRISPR于一管中反应。综上，RT-qPCR作为WOAH推荐的确认样本中是否存在病毒核酸的方法之一，灵敏度高，检测结果准确，但需昂贵仪器，难以被广泛应用；RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD与RT-qPCR方法灵敏度一致，较优于其余3种。临床样本检测结果表明，RT-RAA、RT-RAA-LFD、RT-RAA-CRISPR Cas13a-LFD与RT-qPCR临床诊断的符合率较高，高于RT-PCR的检出率。5种方法整体对H5-AIV检测结果良好，但对仪器设备要求有所差异，检测人员可根据实际情况进行选择。

总之，本研究使用不同分子生物学方法对H5-AIV的检测结果进行了比较和分析，以期为H5-AIV感染的防控提供可靠的技术支撑。