产气荚膜梭菌α毒素荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

杨夷平，李海利，杨 帆，杨 康，段进刚，张国新，李 斌，马春江

（哈密市动物疫病预防控制中心，新疆哈密 839000）

产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringens，Cp）因在动物体内能分解糖类产出大量气体且能形成荚膜而得名，是梭菌属的一种条件性致病厌氧菌。该菌分布广泛，可通过食物、饮用水感染动物，是引起羔羊痢疾和羊、牛犊等动物猝死、肠毒血症、坏死性肠炎的主要病原之一。Cp感染后，动物发病急且往往无明显临床症状，在数分钟或几小时内死亡。Cp感染需经过实验室病原学检测或毒素鉴定才可确诊，严重危害了畜牧业的健康发展[1-4]。Cp的致病性源于其产生的外毒素，此外毒素侵袭力强、种类多，包含α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ、ν等12种。根据外毒素的种类差别，可将Cp分为A、B、C、D、E、F、G 7个型[5-6]。在各种毒素中，α毒素（磷脂酶C）是Cp最为重要的致死性毒素之一，A—G型Cp均可分泌α毒素，且不同型Cp编码α毒素的cpa基因具有相似的核苷酸序列。cpa基因位于Cp染色体上，在各个型之间相对保守[7-9]。

目前Cp的实验室检测以细菌学检查、细菌分离培养和PCR分型鉴定为主，这些检测方法存在依靠主观判断、耗时较长等缺点，不足以应对该病突发时的快速检测和流行病学调查[10]。本研究针对Cp α毒素编码基因的保守序列设计引物和探针，通过优化扩增条件，并对其特异性、敏感性等进行评估，建立了一种TaqMan荧光定量PCR方法，为Cp的实验室检测提供了技术参考。

1 材料与方法

1.1 菌株

Cp A型（CVCC2011）、B型（CVCC1146）、C型（CVCC3831）和D型（CVCC1167），均由中国动物疫病预防控制中心研究员孙雨惠赠；多杀性巴氏杆菌（ATCC12945）、沙门氏菌（ATCC14028）、大肠杆菌（ATCC25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、腐败梭菌（BNCC327578）等，均购自美国模式培养物集存库。

1.2 主要试剂和仪器

2×TaqMan Fast qPCR预混液，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；动物病毒DNA/RNA快速提取试剂盒，购自西安天隆科技有限公司；Cp荧光PCR检测试剂盒，购自某生物公司；其他常规试剂，均为国产分析纯。核酸提取仪，购自西安天隆科技有限公司；实时荧光定量PCR仪（QuantStudioTM3），购自美国ABI公司。

1.3 引物、探针设计与合成

参照NCBI GenBank中收录的Cpcpa基因的完整cds序列（序列号L43548.1），以其作为靶基因，进行Blast同源性搜索。通过ClustalX软件进行比对，筛选出特异性、保守性较高的区域，设计1对特异性引物及探针，引物、探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物、探针信息见表1。

表1 引物、探针序列信息

1.4 荧光定量PCR方法建立及扩增条件优化

以A型Cp DNA为检测模板，参照一步法反转录荧光定量探针试剂盒说明书建立反应体系（20.0 μL）：one step RT- qPCR Probe Mix（2×）10.0 μL，DNA模板2.0 μL，DNF Buffer 2.0 μL，不同组合浓度的上下游引物和TaqMan探针各0.5 μL，最后补充RNase free H2O 4.5 μL。扩增反应程序：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，40个循环，在退火阶段收集荧光信号。设置不同的退火温度（58、59、60、61、62 ℃），筛选出最适退火温度。将引物、探针浓度稀释至10 μmol/L，设置上下游引物浓度和探针浓度分别为0.20、0.25、0.30、0.40 μmol/L，并进行矩阵组合，筛出最佳引物、探针浓度组合。

1.5 敏感性、特异性及重复性试验

1.5.1 敏感性试验 提取A型Cp基因组DNA，测定核酸质量浓度，然后将提取的核酸进行10倍梯度稀释（100～10-6）。以7个稀释度的核酸作为模板（编号1～7），应用本研究建立的荧光定量PCR和普通PCR方法分别进行检测，比较二者的敏感性。

1.5.2 特异性试验 分别提取A—D型Cp、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、腐败梭菌等DNA样本，以蒸馏水为阴性对照，应用本研究建立的荧光定量PCR方法进行检测，验证该方法的特异性。

1.5.3 重复性试验 选取3个稀释度的A型Cp基因组DNA为模板，按优化的条件分别进行荧光定量PCR检测。每个稀释度设置3个重复，计算Ct的平均值及标准差，评估该方法的组内和组间重复性。

1.6 临床样品检测

应用建立的荧光定量PCR方法与商品荧光PCR检测试剂盒，以A型Cp基因组DNA为阳性对照，蒸馏水为阴性对照，对24份临床样品进行检测。

2 结果

2.1 反应条件优化

保持其他条件不变，取A型Cp DNA样本2.0 μL作为反应模板，选择不同的退火温度（58、59、60、61、62 ℃）进行荧光定量PCR反应，结果发现在60 ℃时荧光PCR扩增曲线呈良好的线性关系（S形），因此确定最适退火温度为60 ℃。当加入上下游引物和探针各0.25 μmol/L时，可获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值。因此，最终确定荧光PCR反应体系（20.0 μL）：one step RT- qPCR Probe Mix（2×）10.0 μL，DNA模板2.0 μL，上下游引物和TaqMan探针（浓度均为0.25 μmol/L）各0.5 μL，DNF Buffer 2.0 μL，RNase free H2O 4.5 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，40个循环，在退火阶段收集荧光信号。

2.2 敏感性试验

经检测，A型Cp基因组DNA质量浓度为0.91×105pg/μL。将7个稀释度的A型Cp基因组DNA作为模板，进行荧光定量PCR反应。结果显示，应用建立的荧光PCR方法能检测出5个稀释度（编号1～5）的基因组DNA模板，扩增曲线呈S形，最低检测限为0.91×101pg/μL（图1），而普通PCR检测的最低检测限为0.91×103pg/μL（图2）。结果表明，建立的荧光定量PCR方法比普通PCR敏感100倍。

图1 敏感性试验结果

图2 普通PCR扩增结果

2.3 特异性试验

结果（图3）显示，该方法能扩增A—D型Cp，但对多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、腐败梭菌等病原菌及阴性对照均无特异性扩增。结果表明，该方法具有良好的特异性。

图3 特异性试验结果

2.4 重复性试验

组内和组间重复性试验结果（表2）显示，组内和组间试验标准差均小于0.4，表明该方法具有良好的重复性和稳定性。

表2 荧光定量PCR重复性试验结果

2.5 临床样品检测

本研究建立的Cp α毒素荧光定量PCR检测方法的判定标准：Ct值小于35，扩增曲线有良好的线性关系（S形），则判定为阳性；Ct值为35～38，需进行重复性试验，若2次试验扩增有良好的线性关系（S形），则判定为阳性；Ct值大于38，判定为阴性。应用建立的荧光定量PCR方法与商品试剂盒，对24份疑似Cp感染的样品进行检测，结果显示，检测出阳性样品5份，且两种方法检测结果一致，符合率为100%。随后对5份阳性样本的扩增产物进行序列测定，并比对分析测序结果，发现5份扩增产物的序列与编码Cp α毒素基因片段同源性均为100%，证实扩增产物中含有cpa基因核酸，表明本研究建立的方法可应用于Cp临床检测。

3 讨论

Cp多存在于动物肠道内，一般不会导致动物机体发病死亡，只有当畜体免疫力低下或受到不良因素影响时才会大量繁殖并产生各类毒素，引起畜禽多种疫病。该菌可引起猪、禽、犊牛坏死性肠炎以及羔羊痢疾、羊肠毒血症、羊猝疽、羊猝死等。α毒素是多种类型Cp均可产生的外毒素，引起的疫病大多发病急，缺乏有效的治疗手段[11-12]，提前预防和早日确诊显得尤为重要。

目前，在实验室检测方面，随着分子生物学技术的发展，我国对Cp α毒素检测方法的研究也比较成熟，如检测α毒素各类型的ELISA方法[13-14]，普通PCR检测方法[15-16]，双重或多重PCR分型检测方法[17-19]等，但操作复杂，耗时较长。实时荧光定量PCR技术与普通PCR技术相比有一定技术优势，其操作简单、灵敏度高、重复性好、耗时短、成本相对较低，可为产气荚膜梭菌病的防控提供一定帮助[20-22]。本研究选取编码Cp α毒素的基因片段为靶基因，其相对于其他物种高度特异。经序列比对后筛选出1对特异性引物，引物片段大小控制在25 bp左右，Tm值相差仅0.1 ℃，这使得在同样退火温度下各目的片段都能够获得较好的扩增效率。探针加入后，不仅上下游引物要与模板匹配，探针也需与模板匹配，与引物和探针序列都匹配后扩增的产物才能产生荧光信号，这跟传统引物相比提升了检测特异性。从灵敏度来看，对于一些低拷贝和低浓度样品，随着循环数的增加，容易出现引物二聚体，后者因不是目的片段，没有探针结合位点，所以不会产生荧光信号，更体现了探针法荧光定量PCR的高准确性和高灵敏度。

本研究建立的TaqMan探针荧光定量PCR方法，一方面可通过检测Cp核酸，判断导致家畜突然死亡的主要致死因素，降低临床诊断的误诊率和生化试验的工作量，缩短检测周期，为疫病防控争取时间；另一方面可降低检测成本，尤其适合经费不足的基层检测部门，从而为产气荚膜梭菌病的快速检测和流行病学调查提供有效的技术支撑。