机械力在肝脏类器官形成中的调控作用

王 宁， 吕文良

中国中医科学院广安门医院感染疾病科， 北京 100053

1 肝脏类器官

肝脏是人体内最大的实质器官，主要由肝实质细胞（肝细胞）及非实质细胞［肝星状细胞（HSC）、肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）、胆管细胞、免疫细胞等］构成，在解毒、生物合成、代谢和宿主防御方面发挥着多种作用［1-2］。肝脏具有强大再生能力，能够在损伤后快速增殖自我修复［3-4］，在此过程中，肝细胞快速启动进行复制发挥关键作用，此外，LSEC、HSC、Kupffer 细胞等也参与了肝组织的自我损伤修复过程［5］。尽管如此，慢性病毒感染（HBV、HCV）、嗜烟酗酒的不良习惯、药物、免疫性疾病导致的长期肝损伤，可能会引起各类慢性肝脏疾病的发生，甚至进展为严重肝脏疾病，包括肝硬化、肝癌甚至肝衰竭，严重威胁人民生活健康［6］。目前各种原因导致的肝病已成为全球最主要死亡原因之一［7］。因此，研究肝病发生机制，将有助于对肝脏疾病的诊断和预防，筛选新的治疗靶点，开发新的治疗方案，延缓甚至逆转肝脏疾病的进程。

目前对于肝脏疾病的研究主要依靠细胞系及动物模型，细胞系作为一种二维（two-dimensional，2D）培养，很难模拟体内组织三维（three-dimensional，3D）结构［8］，不能长期稳定地扩增，且缺乏细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用［9］；动物模型虽能模拟组织生长的一定生理环境，但是动物模型构建过程复杂［10］，且种属之间的差异使得大多数人质疑动物模型是否能真实反映人类组织器官功能和疾病状态［11-12］，在比较人类和小鼠的HSC 激活模型时，差异调控基因只有12%～18%的重叠［13］。

近年来兴起的类器官技术能够产生3D结构细胞，更好地模拟体内肝组织［14-15］。类器官是由自组织的胚胎干细胞、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）或成体干细胞（adult stem cell，ASC）体外自组装形成的部分模拟体内器官结构和功能的3D 细胞簇［11，16］，不仅可以在体外大量扩增，且拥有遗传稳定性，更好地反映来源组织的体内特征［17-18］。高度接近于体内组织的特性使类器官培养在短期内迅速发展，不同组织器官的类器官培养系统逐步受到重视并被建立优化。截至目前，已适用于肠道、肝脏、胰腺、肾脏、视网膜、大脑等多种组织［19-26］，在研究疾病发生机制、药物筛选等方面发挥了重要作用［27-29］，并于2018年度被Science杂志评选为年度突破技术。

有关肝脏类器官的研究始于2001年，Michalopoulos等［30］将成年大鼠肝细胞分离出来后培养在胶原包被的转瓶中，并加入各种细胞必需生长因子形成了类似肝脏结构的组织，但其存活期很短。Lgr5 作为成体干细胞的普遍标志物，研究［31］显示受损肝脏在胆管细胞附近检测到Lgr5+表达升高，2013 年，Huch 等［32］利用分离的Lgr5+阳性干细胞构建肝脏类器官，并证实其具有保持体外长期扩增并分化成功能性肝细胞样细胞的能力。除了ASC来源的肝脏类器官，iPCS来源的肝脏类器官也在不断发展，iPSC 诱导分化为中内胚层细胞后得到肝细胞和胆管细胞，3D 培养后进一步得到肝胆类器官［33］，肝脏类器官中肝功能相关基因表达升高，胆管类器官则形成带有初级纤毛的囊状或者分支管状结构，且成熟肝细胞和胆管细胞表面标志物表达均呈上升趋势［34-35］，并能在移植小鼠体内长期生存［36］。不同类型细胞分化而来的肝脏类器官一定程度上模拟肝脏的组织形态、基因表达谱及遗传特征，在疾病模型构建、药物筛选、组织重建及药物安全性评价层面有广泛的应用前景，然而，一个始于细胞且随着胚胎分化逐渐形成能够行使特定功能组织的完整发育过程，在适应环境（持续生长、对抗疾病）过程中会不断受到机械力的影响，长期以来肝脏类器官研究多关注生物学线索，忽略了机械微环境在其形成过程中的关键作用。

2 机械力

生物体从细胞、组织到器官的各个层次上的生命运动都是在一定力学环境中进行的，从个体发育的角度讲，一个只含有一套染色体遗传信息的单细胞，会有序地发生一系列分化增殖，最终形成具有生命活力的完整个体，这个过程是由多种化学反应和物理性质变化所构成的复杂网络系统。随着分子生物学及力学测量技术的不断发展，越来越多学者意识到机械力学在生命形成过程中的重要作用。肝脏类器官作为复杂细胞生长微环境，所呈现的动态生化线索和机械刺激通过机械感应驱动细胞机械转导，最终导致组织结构的变化［37］。研究［38］发现，肝病的进展与异常的组织结构和机械转导密切相关。因此，深入了解机械力在肝脏类器官生成中的作用，对维持肝脏结构的完整和内稳态来说至关重要。

3 机械力与肝脏类器官

生物学活动中，机械力产生、传递、被感知后改变细胞功能，在控制细胞行为和组织稳态中发挥着关键作用。细胞外机械力及其信号传导是细胞微环境中调节细胞增殖、再生、分化和迁移的重要组成部分［39］。研究发现，力学变化始终伴随着“肝炎-肝纤维化-肝硬化-肝癌”的疾病进展过程。而力学对细胞的影响取决于与力和细胞相关的许多因素，包括力的类型、大小、持续时间等，目前研究较多的是固体应力、流体力和细胞外基质（ECM）力学。

3.1 固体应力 固体应力大多出现在组织的高度增殖区域，上皮组织更新或者增殖的肿瘤推动牵拉周围基质时产生［40］。机械应力是诱导iPSC 类器官形成的关键技术，机械力可以通过诱导干细胞中的生物反应刺激iPSC 向软骨细胞分化和成熟。牵引力和张力也是类器官的重要机械调节器。张力作为一种特殊的固体应力，在不同组织界面中产生［41］。正常状态下，细胞-细胞或细胞-基质间的机械张力是胚胎和器官形态变化中的一个重要因素。Muncie 等［42］设计几何图案化的底物模仿正常组织内的特定形状，使得细胞间的张力通过增强Wnt/β-catenin信号通路诱导人类胚胎干细胞（hESC）中“原肠自我组织样”节点的形成，加速胚胎类器官形成。而由hPSC 分化产生的神经外胚层组织观察到较大的牵引应力，且与BMP-Smad 信号通路高度相关，二者共同作用于神经板边界的分化和形成［43］；此外，收缩细胞产生的牵引力可以使胶原纤维排列整齐［44］，通过诱导局部纤维排列和屈曲触发非线性基质硬化（图1a）。另有研究［45］显示，在移植到小鼠肠系膜的人肠道类器官中使用压缩镍钛合金弹簧加入单轴应变，结果显示组织大小及肌肉张力方面，与人类肠道有更高的相似性，提示机械力在肠类器官生成中的促进作用；Li等［46］也在机械压力条件下观察到小肠类器官内分裂的细胞数目明显增加，且小肠干细胞比例明显增加，进一步研究发现力学挤压通过调控LRP6-Axin信号体的形成增强Wnt/β-catenin信号进而调控干细胞的生长，诱导分化成为干细胞纯度更高的小肠隐窝类器官。但固体应力在肝脏类器官形成中的作用还需进一步探索，为体外再现复杂的肝脏生理功能以及疾病病理奠定基础。

图1 类器官形成过程中涉及不同类型机械力示意图Figure 1 Schematic diagram of the different types of mechanical forces involved in organoid formation

3.2 流体力学 流体力学包括静水压力、渗透压和剪切力［47］。静水压力可由高血压相关疾病和肿瘤进展引起。高血压对内皮细胞及周围组织施加的力，以及癌症发展过程中血浆渗漏和淋巴引流不足引起的间质液压力升高导致静水压力的升高［48-49］。渗透压主要出现在人体正常组织中，如人体肠道每天消化会导致渗透压在300～450 mOsm 范围内的规律变化。剪切应力是机体内流体（包括血液、间质液、胆汁等）流动时刺激细胞产生的力，不同类型的剪切力对细胞和疾病产生不同的影响，比如稳定的层流剪切力具有抗炎和保护动脉粥样硬化的作用，而血流紊乱则导致血管炎症及动脉粥样硬化的发生［50］。

肝脏内门静脉和肝动脉的双重供血使其具有复杂的循环系统［1］，特有的流体力学微环境在类器官形成中促进细胞表型方面发挥着重要作用。早期研究发现，肝脏类器官系统虽能诱导细胞大量增殖和分化，但分化并不会导致肝细胞完全成熟，只有不到1%双核细胞，且肝细胞仍不能完全释放白蛋白，为此，Dash 等［51］将大鼠肝细胞在胶原凝胶上培养48 h 后，采用灌注Transwell装置模拟肝窦内血流，恢复体内正常的血流动力学，结果显示应用流体动力学模拟体内机械微环境可以维持体内样肝细胞的表型和代谢功能；Wang等［52］在3D 灌注芯片系统中培养人诱导多能干细胞获得肝脏类器官，并显示出更好的细胞活力和成熟肝脏基因的表达，肝脏特异性功能（白蛋白和尿素的产生及代谢）增强，表明流体流动产生的剪切力在促进肝脏类器官形成中的作用。除此之外，新型的微流控芯片通过定义局部流体剪应力改进对类器官形成的调控。据报道［53］，微流控装置（图1b）促进胚胎和肠道类器官生成；Homan等［54］在微流控芯片下培养肾脏类器官时发现，流体剪切力下的肾脏类器官具有更成熟的足细胞和管状隔室，且细胞极性和成体基因表达增强。相似的，Kang 等［55］采用微流控平台对原代肝细胞和LSEC 共培养，连续灌注后发现原代大鼠肝细胞能维持多边形形态且功能保持时间更长，提示三维灌注培养系统对肝脏结构和持续肝功能的支持作用，但这些系统存在一些缺点，它们依赖于原代肝细胞，且需要导管来同时操作多个设备，使得操作难度增加。肝祖细胞（LPC）衍生的肝脏类器官可在体外分化为肝细胞［56］，但静态培养时LPC体外成熟能力有限，于是Jung 等［57］将LPC 接种在培养基持续流动的微生理系统中，以恒定的流动速率向细胞输送足够的氧气和营养物质，LPC 得以快速生长并缩回成多边形，白蛋白表达增加，生长为成熟肝细胞。Michielin等［58］在对hPSC响应细胞外机械信号分泌蛋白质影响从内胚层到肝脏谱系的进展时发现，微流控环境中的微流体刺激或暴露于外源性ECM 的刺激使得LPC 快速扩增数代并进一步分化成功能性肝细胞，显示出形成肝脏类器官的巨大潜力。

综上，随着生物工程技术的不断进步，微流控装置作为一种新型主动机械刺激装置在控制和研究细胞机械刺激（尤其是流体应力）对于肝脏类器官生长方面有着重要的作用。

4 ECM及其力学

近年来ECM力学在肝脏类器官形成中的作用也成为类器官机械微环境的研究焦点之一［59］。作为结构支架和生化-机械信号的传送器，ECM能够调节从单细胞事件到复杂事件的广泛生物学过程，产生的力是刺激细胞的重要细胞外机械线索，并且对类器官的形成速率和增殖能力有显著影响。层粘连蛋白是ECM中重要且拥有生物活性的部分，研究［60］发现，加有层粘连蛋白511/521 的基质上分化的肝细胞特异性标志物表达增多，且白蛋白分泌增多，体现ECM 在类器官形成中的作用。

刚度是ECM力学最重要的外在表现。人体中不同的组织和器官具有其独特的刚度，脂肪和大脑的刚度在500～1 000 Pa，而骨的刚度高达2～4 GPa。模拟ECM力学的生物材料（如水凝胶）进行3D细胞培养，已成功地用于培养来自患者和小鼠的原代细胞分化的类器官。Gjorevski等［61］发现，具有较高刚度的黏附肽-聚乙二醇水凝胶通过Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）促进肠类器官的形成；Ng等［62］使用合成的酶交联水凝胶模拟肿瘤生长微环境，结果发现较高基质硬度与缺氧的化学环境共同作用结直肠癌患者来源类器官生长和代谢；Zhang等［63］则发现螺旋聚异腈多肽水凝胶（PIC）促进乳腺类器官的形成；模拟胰腺癌微环境中水凝胶硬度的增加，使得胰腺类器官感应机械信号并表达致瘤基因；将类器官置于具有不同刚度（1和60 kPa）的聚丙烯酰胺水凝胶中发现较软硬度促进肾类器官的生长和分化。

有关刚度在肝脏类器官形成中作用的研究也越来越多。HSC 接种在不同成分的水凝胶上，通过调控周围机械微环境促进3D 培养肝脏类器官的生成（图1c）［64］；Liu 等［65］采用具有应力刚化性质的PIC 胶作为基质对肝癌细胞HepG2进行3D培养后发现，ECM力学刺激通过力学传感器YAP 和KCa3.1 钾通道调控肝癌细胞的增殖、迁移等行为，加速类器官形成。Sorrentino 等［66］采用一种化学成分的水凝胶模拟肝脏力学微环境，证实较硬水凝胶促进肝脏类器官的形成。在此过程中，Hippo 通路核效应蛋白YAP 作为整合素下游微环境机械信号转导的关键蛋白［67］，整合素/YAP 级联通路通过响应ECM 力学信号促进肝脏类器官生长，并发现异常的基质硬度会导致LPC 增殖能力受损。另外，肝脏类器官的每一细胞都与ECM 有物理接触，并且通过表面的整合素与ECM 中的生化配体进行机械黏附［68］。ECM 硬度通过细胞骨架将力学信号传递到细胞核，促进细胞增殖、分化、迁移或凋亡［69］，如肌动蛋白聚合延长突起改变其形态［70］，细胞骨架作为机械支架，又与肌球蛋白协同发挥收缩张力［71］，内部和外部的物理力量通过细胞骨架影响局部的力学性质和细胞行为。

除了ECM 刚度，其他的力学性能，如非线性弹性、黏弹性、塑性和孔隙弹性等也是类器官形成中的重要调节因子［37］。ECM 组分的纤维结构使研究者在哺乳动物和生物聚合物中观察到非线性弹性，且随施加应力的增大而增大［72］。自然界大多数生物组织和基质都具有黏弹性，并表现出应力松弛的行为。在目前的合成黏弹性材料中，应力松弛在细胞的扩散、迁移和神经元祖细胞的自我更新过程中展现出重要作用［73］。Rizwan 等［74］设计黏弹性透明质酸水凝胶模拟肝组织的应力松弛用于原代胆管细胞的培养，发现黏弹性产生的应力松弛与Notch 信号相互作用，通过增加YAP靶基因的表达诱导胆管细胞类器官生长。

类器官中的细胞通过动态过程对力学刺激作出反应，并适应不断变化的条件。因此，分析细胞-ECM相互作用在肝脏类器官形成中的意义可能是探究疾病中组织紊乱和药物反应的一条新道路。

5 小结与展望

类器官作为体外培养的某种类型器官的微型再现，再现了人体器官和组织的部分结构，在疾病建模、药物研发和组织/器官替代治疗等方面具有重要意义。临床研究证明，患者来源的类器官通过模拟免疫、肿瘤、代谢或感染性疾病，使得研究健康和疾病状态下器官间的细胞通信和分子机械信号成为可能［75］。近年来，采用仿生材料模拟细胞和组织生长的机械微环境已成功用于培养患者或小鼠体内分离的原代细胞，也能更好地调节肝脏类器官形成。体外主动机械刺激装置可以通过刺激响应聚合物、微流控装置和磁性材料等实现；体内可以通过置入软机器人来实现。最近报道了一种微尺度动态软储层植入组织后通过改变固体应力、流体剪应力及周围组织的细胞活性从而调节生物-非生物界面的生物力学，将软机器人与多孔储层耦合增强药物在体内运输，促进其药代动力学［76］。因此，在肝脏类器官中探索细胞微环境机械力和生化信号转导的相互作用具有重要意义，通过理解生物和非生物因素之间的相互作用，为肝脏类器官生成系统提供了一个新的视角，以期更好地指导临床治疗。

利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。

作者贡献声明：王宁负责起草和修订论文；吕文良负责论文框架设计，终审论文并最后定稿。