响应面法优化黄精活性成分的提取工艺*

沈良洪，翟欣欣，李鹏飞，郭信东

（贵州中医药大学中药民族药资源研究院，贵州贵阳 550025）

黄精（Polygonati rhizoma）为百合科黄精属植物，其根茎可入药，为“药食同源”中药，具有极高的开发使用价值，主要用于脾胃气虚、体倦乏力、胃阴不足、口干食少、肺虚燥咳、劳嗽咳血、精血不足、腰膝酸软、须发早白、内热消渴等症状[1，2]。黄精的化学成分丰富，主要含有多糖、皂苷、黄酮、多酚等活性成分，具有降血糖、抗病毒、抗肿瘤、提高免疫力、抗衰老、抑制炎症因子等功效[3，4]。

黄精在药品、保健品等领域用途广泛，市场需求量呈逐年上升趋势。随着野生黄精的过度采挖，种植黄精呈现逐年增长的态势[5，6]。2020 年贵州省黄精累计种植面积达16.36 万亩，同比增长84.82%；当年产量为2.67 万t，同比增长89.73%；当年产值为4.65 亿元，同比增长139.80 %，其中，天柱县是贵州省最大的黄精种苗培育基地，2022 年全县已种植6000 余亩，综合产值超过3300 万元[7]。虽然黄精的规范化种植已深入人心，但系统优化其活性成分提取工艺的研究仍未见报道。

本实验选择黄精多糖、皂苷、黄酮、多酚进行了单因素筛选，并在此基础上，运用响应面法系统优化黄精活性成分提取工艺，得到了优化的黄精活性成分提取方法，以期为中药黄精的合理开发使用提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与药材

UV-2700 型紫外可见分光光度计（岛津仪器苏州有限公司）；SB25-12DTD 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；EL104 型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

葡萄糖对照品（批号:DKW1-3099）、人参皂苷Rb1对照品（批号: 110704-201122），中国食品药品检定研究院；芦丁对照品（批号:0080-9705 中国药品生物制品检定所）；没食子酸对照品（批号:AF20050701 成都埃法生物科技有限公司）；蒽酮（批号: 20191024）、浓H2SO4（批号: 20210901）、HClO4（批号: 20170113）、苯（批号: 20111017），国药集团化学试剂有限公司；冰醋酸（批号: 20180501）、乙酸乙酯（批号: 2101041）、正丁醇（批号: 2104041），上海申博化工有限公司；甲醇（批号: 20220528 天津市科密欧化学试剂有限公司）；乙醇（批号:20220401）、石油醚（批号: 20200601），天津市富宇精细化工有限公司；以上试剂均为分析纯。

黄精购于四川鑫仁泰药业有限责任公司（批号:202001，生品1）和安顺市西秀区钰霖种养殖农民专业合作社（批号:20210401，生品2）。

炮制品黄精 酒黄精购于安徽尚德中药饮片有限公司（批号: 200202，炮制品1）；酒黄精购于贵州同源中药发展有限公司（批号:180401，炮制品2）；酒黄精购于上海万仕诚药业有限公司（批号: 200207-1，炮制品3）；酒黄精购于重庆众景中药饮片有限责任公司（批号:191120，炮制品4）。

1.2 方法

1.2.1 供试品的制备 取黄精饮片，60℃烘干，粉碎后过6 号筛，精密称定5g 置于150mL 锥形瓶中，加入70%乙醇50mL，温度设置为25～70℃，超声时间为10～60min，超声频率为16～36kHz，料液比（g∶mL）为1∶5～1∶20，总计20 份供试品提取过滤后，用70 %乙醇定容至100mL 容量瓶中备用。

1.2.2 黄精多糖、皂苷、黄酮和多酚的分离 取供试品溶液80mL 置于蒸发皿中水浴蒸去乙醇，加入10mL 热水后，转移至分液漏斗中，依次使用石油醚、苯、乙酸乙酯、正丁醇4 种溶剂分3 次萃取，每次20mL。石油醚去除叶绿素等脂溶性成分后，分别得到黄精总酚、总黄酮、总皂苷以及水层中总多糖组分，将4 个组分分别转移至蒸发皿中水浴蒸干。使用甲醇溶解黄精总酚、总黄酮并定容至5mL 容量瓶中；甲醇溶解黄精总皂苷定容至50mL 容量瓶中，取其中1mL 稀释液转移至10mL 容量瓶中；使用热水溶解黄精多糖定容至100mL 容量瓶中，取1mL 多糖溶液稀释至50mL 容量瓶中，摇匀即得。

2 结果与讨论

2.1 建立含量测定方法

分别以葡萄糖、人参皂苷Rb1、芦丁、没食子酸配置对照品溶液，选择蒽酮-硫酸比色法、香草醛-冰醋酸比色法、福林酚比色法和三氯化铝-醋酸-醋酸钠比色法分别显色并建立标准曲线[8-12]（详见表1）。

表1 对照品线性关系、相关系数及线性范围Tab.1 Result of reference standard curve table,correlation coefficient and linear range

精密量取黄精多糖组分0.25mL、黄精皂苷组分1mL，分别以水和甲醇为空白对照，使用蒽酮-硫酸比色法和香草醛-冰醋酸比色法测定总多糖和总皂苷含量；精密量取多酚组分和黄酮组分各1.5mL 置于25mL 和10mL 容量瓶中，均以甲醇为空白对照，分别使用福林酚比色法和三氯化铝-醋酸-醋酸钠比色法测定总酚和总黄酮的含量。

由表1 可见，建立的黄精4 类成分含量测定方法稳定、可靠、线性范围广，可应用于黄精中多糖、皂苷、多酚及黄酮类成分的含量计算。同时，为黄精中活性成分的提取工艺优化及其应用奠定了基础。

2.2 单因素考察

本实验选取影响提取效率的4 个主要因素进行研究，分别为超声时间，超声温度、超声频率和液料比。单因素考察结果见图1。

由图1 可见，黄精多糖、皂苷、总酚和黄酮类成分的提取时长设置在10～50min 内能够得到最大的提取率。4 类成分在31～54℃之间存在最适超声温度；在24～32kHz 之间存在最优的超声频率；料液比设置在1∶5～1∶15 之间存在最佳的吸光度。

2.3 响应面优化提取工艺

2.3.1 基于中心组合设计优化液料比和超声频率根据单因素考察结果，选择超声频率（C）、液料比（D）为自变量，以总多糖、总皂苷、总黄酮和总酚为响应值进行两因素三水平响应面优化（见表2），根据中心组成实验设计原理以超声频率（kHz）24.00、28.00、32.00 和液料比（mL∶g）5.00、10.00、15.00 代替编码水平设计响应面实验，正交实验及结果见表3。对13 次正交实验结果分析发现，5 次重复实验活性成分含量较高且相近，距离中心点较远的活性成分含量较低，说明中心组成实验设计集中，能够得出较好的实验结果。

表2 正交实验设计因素水平表Tab.2 Factor level table for orthogonal experimental design

表3 正交实验及结果Tab.3 Orthogonal test and results

2.3.2 以总黄酮为例对建立的回归模型进行方差分析 经Design expert 8.0.6 对表3 数据进行拟合分析后，以总黄酮为例进行方差分析（详见表4），建立模型P值＜0.01 具有极显著性，失拟项P值＞0.05 不显著,表明所建立模型对实验数据拟合情况良好；且D、CD、C2和D2对总黄酮提取有极显著影响（P值＜0.01），同时可以体现两因素对总黄酮提取的影响大小为:液料比＞超声频率。

表4 总黄酮响应面回归模型方差分析结果Tab.4 Results of analysis of variance with total flavonoids response surface regression model

2.3.3 响应面交互作用分析 总多糖、总皂苷、总黄酮和总酚响应面交互作用分析见图2。由图2（A）可见，黄精多糖响应面三维立体图比黄精皂苷、黄酮和多酚响应面三维立体图弧度小，表明黄精多糖受液料比和超声频率影响较小。图2（B）、2（C）和2（D）的响应面三维立体图弧度较大，表明黄精皂苷、黄酮和多酚受液料比和超声频率影响较大。综合图2 可知，液料比对黄精活性成分的提取率较超声频率影响更显著。同时，4 类成分均随液料比和超声频率的增加先增加后减小, 反映出上述建立的模型对于黄精活性成分提取存在正向最优值，表明该模型交互作用显著，与方差分析结果一致。

图2 吸光度随液料比和超声频率的变化情况Fig.2 Absorbance changes with liquid-solid ratio and ultrasonic frequency

2.3.4 提取参数的确定 经Design Expert 8.0.5 对响应面实验结果拟合分析，得出优化后的4 类成分的提取参数: 黄精多糖超声频率和液料比分别为24.00kHz 和10.35；黄精皂苷超声频率和液料比分别为27.60kHz 和12.44；黄精黄酮超声频率和液料比分别为28.40kHz 和10.71；黄精多酚超声频率和液料比为28.00kHz 和10.84。综合考虑4 类成分的提取工艺后确定最终提取参数为：超声频率为24.80kHz，液料比为10.62。

2.5 优化结果的验证

随机选取6 批次黄精样品，将优化的提取工艺应用于黄精药材和黄精炮制品中，按1.2、2.1 和2.3项下方法提取并测定黄精中多糖、皂苷、多酚和黄酮的含量，结果见表5。

由表5 可见，通过对6 批次黄精样品响应面优化、单因素优化、未优化提取工艺比较发现，响应面法优化的黄精提取工艺较单因素优化的黄精提取工艺具有较大提升；而单因素优化的黄精提取工艺较未优化的提取工艺也具有较大提升。

图3 为生品1 在未优化时、单因素优化后和响应面法优化后4 类成分的含量对比图。图3（A）是以黄精多糖和皂苷成分为横坐标，以每g 生品1 中检测出多糖和皂苷的含量为纵坐标建立的柱状图。图3（B）是以黄精多酚和黄酮成分为横坐标，以每g 生品1 中检测出多酚和黄酮的含量为纵坐标建立的柱状图。

图3 不同提取方法对生品1 中4 类成分提取率的影响Fig.3 Effect of different extraction methods on extraction rate of 4 components in raw 1

由图3 可见，响应面法优化后的黄精多糖提取率较单因素法优化黄精多糖提取率提升了1.51 倍，较未优化时增加了11.07 倍；响应面法优化后的黄精皂苷提取率较单因素法优化后的黄精提取率提升了3.65 倍，较未优化时增加了5.94 倍；响应面法优化后的黄精多酚提取率较单因素法优化后的黄精提取率提升了2.03 倍，较未优化时增加了4.74 倍；响应面法优化后的黄精黄酮提取率较单因素法优化后的黄精提取率提升了1.89，较未优化时增加了2.05 倍。从而验证了响应面优化黄精提取率＞单因素优化黄精提取率＞未优化的黄精提取率。

3 结论

本实验以黄精多糖、皂苷、多酚和黄酮为研究对象，运用单因素筛选、响应面优化技术，结合黄精中4 类活性成分的提取率，确定提取的超声频率为24.80kHz，料液比为1∶10.62，此时，黄精活性成分的提取率达到最佳。

将建立的提取工艺应用于黄精药材，发现实际值与预期值无显著差异。同时，扩大优化工艺应用于炮制品黄精及其他黄精饮片。结果显示，响应面法比单因素考察优化效果理想，提取效率显著增加。同时，扩大应用范围至4 批次炮制品黄精后，黄精活性成分的提取率得到了较大的提升。由此可知，建立的优化工艺模型可靠稳定、适用范围广。同时，可为中药黄精的开发及合理利用提供理论支持。此外，本文建立模型的思路还可为其他中药材的开发提供指导性意见。