大豆蛋白-葡聚糖共价物酶法凝胶的冻融稳定性研究

张梦玥，刘竞男，陈 鹏，王 旭，王喜波，徐 宁

（东北农业大学食品学院 哈尔滨 150030）

大豆分离蛋白（Soy protein isolate，SPI）不仅营养价值高，还有良好的凝胶性，常被添加于冷冻肉制品、面制品和速冻食品中，改善其质构特性，增加保水性，提高品质。然而，冷冻食品在运输和贮藏时，由于环境温度、pH 值、离子强度等发生变化，易反复经历冷冻-解冻过程（即冻融循环，Freeze-thaw cycle，FTC），SPI 凝胶有序的网络结构会被破坏，产生收缩、变硬、持水能力减弱等现象，导致食品劣变[1-2]。因此，提高SPI 凝胶冻融稳定性，满足冷冻食品行业需求，已成为此领域亟需攻克的技术难题。

适度的美拉德反应能够改变蛋白质结构，改善蛋白的凝胶特性，例如提升凝胶强度、持水性，改善凝胶弹性等[3-6]。谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase，TG）能够催化谷氨酰基（酰基供体）和各种伯胺化合物（包括赖氨酸残基中的ε-氨基，即酰基受体）之间发生酰基转移反应[7]。蛋白质发生美拉德反应后，分子结构伸展，内部的赖氨酸残基暴露，TG 酶的结合位点增加，更易形成蛋白质分子内和分子间的γ-谷氨酰基-ε-赖氨酸异肽键，增强交联效应，使得凝胶网状结构紧密、有序，抵御外界环境对凝胶网络的破坏。

目前，Zhang 等[8]、Yu 等[9]、孙洪蕊等[10]已证实葡聚糖与SPI 发生美拉德反应可有效增强蛋白乳液抗冻性，然而，针对蛋白凝胶抗冻性的研究较少，关于TG 酶法制备的大豆分离蛋白-葡聚糖共价物凝胶的冻融稳定性的研究也鲜有报道。本文采用TG 酶交联不同蛋白质量浓度（30，40，50，60 mg/mL）的SPI-D 凝胶，通过测定接枝度、SDSPAGE、内源荧光光谱、表面疏水性来分析SPI-D结构变化，再通过质构测定及扫描电镜等方法，与SPI、D 混合物（SPI+D）凝胶、SPI 凝胶进行对比，研究其在冻融循环中持水性、硬度、弹性、可溶性蛋白含量及微观形貌变化，旨在为制备抗冻大豆分离蛋白提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

脱脂豆粕，山东禹王有限公司；葡聚糖，国药集团化学试剂有限公司；TG 酶，江苏一鸣生物有限公司；ANS 荧光探针，Sigma 公司；其它试剂均为分析纯级。

1.2 仪器

TU-1800 型紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；F-4500 型荧光分光光度计，日本日立公司；TA-XT2i 型质构仪，英国SMS 公司；扫描电子显微镜，日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI 制备 按照Wang 等[11]方法，将粉碎过筛后的脱脂豆粕以质量比1∶10 溶于去离子水，取2 mol/L NaOH 溶液，调节pH 值至8.5，室温混匀1 h 后，4 000 r/min 条件下离心30 min。收集上清液，用HCl 溶液（2 mol/L）调节pH 值至4.5，室温静置2 h 后，弃去上清液，4 000 r/min 离心15 min，将沉淀用去离子水洗涤3 次，复溶后，用NaOH 溶液（2 mol/L）中和pH 值至7.0，4 ℃条件下透析24 h 除盐，储存在-20 ℃冰箱内预冻，冷冻干燥后置于-20 ℃冰箱中备用。

1.3.2 样品制备 SPI-D 制备方法如下：将SPI与葡聚糖（D）以质量比3∶1（SPI 质量浓度分别为30，40，50，60 mg/mL）溶于PBS 缓冲液（0.01 mol/L、pH 7.0）中，25 ℃下搅拌4 h，加入叠氮钠4 ℃水合过夜。密封样品液，95 ℃水浴搅拌3 h 后，迅速冷却至室温得到SPI-D 样品。未经加热的SPI 与葡聚糖混合物为SPI+D 样品。冷冻干燥后备用。

1.3.3 接枝度（DG）测定 取200 μL 样品溶液，添加至4 mL 邻苯二甲醛溶液（OPA）中，混匀后置于水浴锅内，35 ℃反应2 min，测量波长340 nm 测量吸光度，空白对照为去离子水[12]。其中，OPA 试剂现用现配，用1 mL 去离子水溶解40 mg 邻苯二甲醛，再按照顺序加入2.5 mL 十二烷基磺酸钠（SDS）溶液、25 mL 硼砂溶液（0.1 mol/L）、0.1 mL β-疏基乙醇，最后用去离子水定容至50 mL。

式中，A0——未发生反应的吸光值；A1——反应后的吸光值。

1.3.4 接枝反应程度的测定 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法，使用质量分数5%的浓缩胶和13%的分离胶，将样品溶液（质量浓度为5 mg/mL）与5×SDS 上样缓冲液按体积比4∶1 混合，沸水浴5 min 后冷却至室温备用。取10 μL 样品液注入点样孔中，浓缩胶中电压为90 V，进入分离胶后以120 V 进行电泳，溴酚蓝与凝胶底部相距约1 cm 时终止电泳、起胶[13]。完成电泳后，移入考马斯亮蓝溶液中染色12 h，再使用脱色液洗脱3～4 次，直至出现清晰的条带。

1.3.5 表面疏水性的测定 样品溶液处理方式如下：稀释蛋白质量浓度至0.02，0.01，0.005 和0.0025 mg/mL。取8 mL 样品溶液，加入20 μL 的ANS 荧光探针（8 mmol/L）混匀，25 ℃避光15 min后，进行荧光强度测定。参数设置如下：激发波长390 nm、发射波长470 nm，狭缝5 nm[14]。以测得的荧光强度为纵坐标，蛋白质质量浓度为横坐标，进行作图，蛋白质表面疏水性指数即为线性关系良好的回归线斜率。

1.3.6 内源荧光强度的测定 将样品液用PBS 缓冲溶液（0.01 mol/L、pH 7.0）稀释，蛋白质量浓度为5 mg/mL 时，固定激发波长347 nm，发射波长375～550 nm；蛋白质量浓度为0.5 mg/mL 时，固定激发波长290 nm，发射波长300～400 nm。狭缝5.0 nm，速度240 nm/min[15]。

1.3.7 凝胶制备及冻融循环 用PBS 缓冲溶液（0.01 mol/L、pH 7.0）溶解各组样品，并将蛋白质量浓度配制为100 mg/mL，再加入TG 酶（酶与蛋白质量比3∶100）溶解，调节体系pH 值至7.0。在45 ℃水浴锅中反应2 h 后，90 ℃加热10 min，制得的凝胶样品于4 ℃保存过夜。

1 次冻融循环（1 FTC）流程如下：将凝胶样品放入-20 ℃冰箱中冷冻22 h，取出后，移至25 ℃的水浴锅，解冻2 h。试验中，每组样品历经5 次冻融循环（5 FTCs）。

1.3.8 持水性（WHC）测定 参照Cui 等[16]的方法，取适量凝胶样品置于离心管内，4 000 r/min 离心15 min，离心结束后小心弃去离心管内水分。

式中，mt——离心前凝胶样品、离心管的总质量，g；mr——离心后凝胶样品、离心管的总质量，g。

1.3.9 质构测定 采用TA-XT2i 型质构仪（探头：P/0.5 柱形）进行测定，试验前，将样品在25 ℃下平衡0.5 h，设置每测定1 次，探头下压2 次，下行速度：1 mm/s，检测速度：5 mm/s，后撤速度：5 mm/s，触发力为5 g[17]。

1.3.10 可溶性蛋白含量测定 按照Zhou 等[18]的方法，切取凝胶样品，研磨破碎，溶解于PBS 缓冲液（0.01 mol/L、pH 7.0）中，定容后磁力搅拌30 min，以10 000 r/min 离心0.5 h。考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白质的含量。

1.3.11 扫描电镜测定 蛋白凝胶样品处理方法如下：将制得的凝胶切成小块后，在戊二醛固定液（体积分数2.5%，pH 6.8）中浸泡24 h。取出用0.1 mol/L PBS 缓冲液冲洗后脱水：1）用体积分数50%，70%，90%乙醇溶液各进行一次。2）用体积分数100%的乙醇溶液脱水3 次。3）用等体积乙醇（100%）和叔丁醇的混合液置换，时间15 min。4）纯叔丁醇溶液置换，时间15 min。脱水后将样品进行冻干，镀金（5 kV，15 mA，1.5 min）后移至扫描电子显微镜下进行观察[19]。

1.3.12 数据处理 所有试验重复3 次，使用SPSS 23.0 进行数据处理和方差分析（单因素ANOVA，P<0.05 表示差异显著），采用Origin 2018软件作图。试验结果均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 SPI 质量浓度对接枝度的影响

通常采用接枝度来反映美拉德反应进程，不同蛋白质量浓度的SPI-D 接枝度如图1 所示。蛋白质中的游离氨基与多糖的羰基发生美拉德反应，生成SPI-D 共价物[8]，随着SPI 质量浓度的不断增加，SPI-D 的接枝度先升高后降低，当SPI 质量浓度为50 mg/mL 时，达到最大值12.54%。SPI质量分数的增加导致体系中底物浓度变大，化学反应速度提高，然而，当蛋白质量浓度高于50 mg/mL 时，溶液黏稠度增加，不易流动，同时产生空间位阻效应，阻碍美拉德反应的进行，接枝度下降[20]。

图1 SPI 质量浓度对接枝度的影响Fig.1 Effects of SPI mass concentration on the degree of grafting

图2 SPI、SPI-D 和SPI+D 的SDS-PAGE 图谱Fig.2 SDS-PAGE spectra of SPI，SPI-D and SPI+D

2.2 接枝反应进行程度分析

SDS-PAGE 是一种常用的蛋白质分析方法，能够进一步证实大豆分离蛋白与葡聚糖间共价键的生成[21]。由泳道5～9 可以看出，与SPI 相比，SPI+D 条带几乎没有变化，说明葡聚糖与SPI 仅为简单混合，并未发生反应；泳道1～4 在分离胶顶部区域（高相对分子质量区）出现密集的谱带，连续性较强，并且1～4 泳道SPI 质量浓度依次增加，谱带颜色逐渐变深，其中泳道3 的条带颜色最深，泳道4 次之，证实了SPI 与葡聚糖之间美拉德反应的进行，有高分子质量共价物生成，当SPI 质量浓度为50 mg/mL 时，反应程度最大。

2.3 内源荧光光谱分析

荧光物质是美拉德反应中褐色色素的前体物，可以表征反应进行程度[15]。图3a 为固定激发波长347 nm 扫描得到的荧光光谱，其荧光强度反映了高级阶段荧光物质的产生状态。由图可以看出，SPI+D 的光谱曲线与SPI 十分接近，没有荧光物质产生。SPI-D 的最大荧光强度（λmax）向短波方向移动，发生蓝移，显著高于对照SPI，SPI50-D（SPI 质量浓度为50 mg/mL）荧光强度达到最高值，表明了美拉德反应特征荧光小分子的生成。

色氨酸残基对微环境的变化很敏感，内源荧光光谱主要通过观察其周围构象和极性改变来呈现蛋白质三级结构的变化[22]。如图3b 所示，固定激发波长290 nm 扫描时，相较SPI、SPI+D，不同蛋白质量浓度SPI-D 接枝物的荧光强度均存在降低现象，这是由于糖与蛋白共价结合，对色氨酸残基具有屏蔽作用，蛋白分子结构展开，发色基团在溶剂中暴露，导致荧光强度下降，SPI-D 内源荧光光谱λmax发生红移（即向长波方向移动），表明葡聚糖键合对SPI 有显著的荧光猝灭作用，色氨酸残基周围环境极性更高，亲水性较强，蛋白质三级结构变得松散，更易发挥功能特性[23]。

2.4 表面疏水性

表面疏水性（H0）反映了疏水基团的分布，由蛋白质表面残基暴露的程度决定，体现了蛋白质空间结构的变化，也能够影响其功能性质[24]。如图4 所示，SPI+D 混合物表面疏水性与SPI 无显著差异（P＜0.05），说明葡聚糖的单纯加入对SPI 的表面疏水性不会产生影响。然而，SPI-D 表面疏水性显著高于SPI、SPI+D，并且当SPI 质量浓度为50 mg/mL 时，表面疏水性达到最高为6 649.2，较对照SPI 提高了23.96%。这是由于大多数疏水基团都埋藏在致密球状区域内部，美拉德反应改变蛋白构象，导致聚集体解离或蛋白质去折叠，表面疏水性有所增加[25]。

图4 SPI 质量浓度对表面疏水性的影响Fig.4 Effects of SPI mass concentration on surface hydrophobicity

2.5 凝胶持水性

持水性能够反映蛋白质-水之间在凝胶网络内的相互作用，表征凝胶吸收和保持水分的能力，是影响凝胶稳定的重要功能特性之一[26]。如图5所示，未经冻融时，SPI50-D 凝胶的持水性高达91.33%，1 FTC、3 FTCs、5 FTCs 后，持水性分别为67.11%，61.83%，58.87%，因为反复冷冻-解冻，游离水、结合水形成低密度冰晶，体积逐渐加大，凝胶结构变得粗糙，孔径随之扩大，为凝胶体系中的水分提供了更多自由流动的空间，凝胶持水性整体降低[27]。

图6 SPI 质量浓度对凝胶质构的影响Fig.6 Effects of SPI mass concentration on gel texture

图7 SPI 质量浓度对凝胶可溶性蛋白含量的影响Fig.7 Effects of SPI mass concentration on soluble protein content of gel

5 次冻融后，SPI 凝胶持水性减少了44.98%，变化幅度在所有试验组中最大，SPI+D 凝胶的持水性降低42.81%，相较SPI 凝胶无明显改善，说明多糖的单纯加入并未提升凝胶持水性[28]，而SPI50-D 凝胶持水性仅降低了32.46%，保水能力优于SPI、SPI+D 凝胶。SPI-D 引入糖分子，比蛋白本身具有更多亲水性基团，提升了与水分子的结合能力，而糖链空间位阻可以防止蛋白过度交联，糖链上的羟基与蛋白质分子部分基团结合，抑制蛋白分子间作用，防止其聚集[29-30]，这些变化都能够促进平滑匀称的凝胶网络形成，使得结构更为致密，抵御冰晶的破坏，束缚更多的水分子，维持SPI-D 较好的凝胶持水性，提高冻融稳定性。

2.6 凝胶质构

凝胶硬度和弹性是评价质构特性的重要指标，能够表征蛋白分子间作用力的强弱及凝胶结构致密程度、抵抗外力压缩能力[2]。冻融后，凝胶体系产生冷冻浓缩效应，蛋白质分子重新紧密排列，相互作用增强，并伴随着水分子析出，取代了蛋白质-水的作用[31]。历经5 FTCs，SPI 凝胶硬度和弹性分别增加了938.96 g、0.10 mm，而SPI+D 和SPI50-D 凝胶硬度和弹性分别增加了818.80 g、0.08 mm，弹性分别增加了324.03 g、0.04 mm，变化幅度顺序为：SPI50-D＜SPI+D＜SPI，在冻融循环过程中，SPI50-D 硬度、弹性变化程度都最小，说明SPI-D 凝胶抵御劣变的能力增强，质构特性保持得最好。

2.7 可溶性蛋白含量

蛋白质分子聚集构成了凝胶网络，三维结构由相互连接的蛋白质骨架组成，测定可溶性蛋白质含量能够衡量蛋白质参与形成凝胶的程度[18]。冷冻引起蛋白变性，凝胶结构进一步重排，蛋白分子发生聚合，原本的游离蛋白结合到了凝胶体系中，引起可溶性蛋白含量降低[31]。同时蛋白质肽链展开，疏基总基团转化为二硫键，疏水作用力减弱，在蛋白质-蛋白质相互作用下，可溶性蛋白结合到原先的凝胶网络中，形成更粗糙、不规则的三维结构，导致凝胶品质劣变[32]。

5 FTCs 后，SPI、SPI+D 凝胶可溶性蛋白含量分别降低了7.17%，3.61%，而SPI50-D 凝胶可溶性蛋白含量为12.79%，仅降低2.05%，各试验组可溶性蛋白含量变化幅度为：SPI-D＜SPI+D＜SPI。美拉德反应减少了冻融过程中酶法凝胶可溶性蛋白的降低量，也能防止蛋白分子因脱水形成不溶性聚集体，抵御冻融循环对凝胶结构的破坏。

2.8 凝胶微观形貌变化

扫描电子显微镜（SEM）能够直观地展示蛋白质凝胶的微观三维网格结构，图8 显示了不同SPI 质量浓度凝胶在未冻融时及冻融循环5 次后，放大×100 和×5 000 下的微观形貌图。5 FTCs后，凝胶的表面结构破裂、塌陷，内部平均孔径增大，凝胶基质变得疏松，低温使得凝胶中水分冻结形成低密度冰晶，冰晶嵌入，呈蜂窝状结构，结冰膨胀压力和渗透压力也会显著破坏凝胶形貌[33]。凝胶被破坏程度：SPI＞SPI+D＞SPI-D，SPI 凝胶、SPI+D 凝胶网络都有局部断裂现象出现，冻结形成的大冰晶破坏了三维网格结构，而SPI-D 凝胶相对均匀、致密、规则，且SPI 质量浓度为50 mg/mL 时，凝胶微观结构保持得最好，在高放大倍数（×5 000）下可以明显观察到致密网络结构，蛋白质间相互交联，孔洞细小、均匀，表征了较好的持水性，这是由于美拉德反应使SPI 结构打开，有利于TG 酶的交联作用，葡聚糖的结合也能增加蛋白表面疏水性，分子间斥力也随之增加，抑制蛋白质分子间聚集变性，减少冰晶的形成，显著提高凝胶强度[34]，提升凝胶冻融稳定性。

图8 不同SPI 质量浓度蛋白样品凝胶冻融前、后的SEM 图Fig.8 SEM images of protein samples with different SPI mass concentration before and after gel freeze-thaw

3 结论

1）通过接枝度测定和SDS-PAGE 试验表明大豆分离蛋白与葡聚糖发生了美拉德反应，生成大豆分离蛋白-葡聚糖共价物（SPI-D），表面疏水性和内源荧光光谱分析证明了SPI 结构的变化，蛋白分子结构伸展、柔性增大，有美拉德反应的特定荧光物质生成。

2）经过5 次冻融循环，当SPI 质量浓度为50 mg/mL 时，TG 酶交联下的SPI-D 凝胶的持水性、可溶性蛋白含量与SPI、SPI+D 凝胶相比，降低程度最小，硬度、弹性等质构特性也保持得最佳，同时扫描电子显微镜观察到，SPI-D 凝胶冻融后呈现均匀纤维网状结构，表面平滑，基质更加紧密，凝胶形貌优于与对照组。本研究证明美拉德反应切实有效增强了TG 酶法SPI-D 凝胶的冻融稳定性，对制备冷冻食品专用的大豆分离蛋白具有理论与实践价值，应用前景广阔。