液态发酵茯苓菌有机相提取物抗氧化活性研究

2023-12-15陈林

化工设计通讯 2023年11期

陈林

（常德职业技术学院药学系，湖南常德 415000）

自由基是机体代谢过程中的产物，正常水平下对机体的细胞生长、环核苷酸合成有着调节作用。这种物质尤其活跃且极不稳定，容易附着于健康细胞上夺取脂肪、蛋白质、DNA 等分子的电子，使细胞结构破坏，引起多种疾病发生。如炎症、癌症、心血管等疾病的发生，都与机体自由基过剩或消除能力减弱有关[1-7]。

茯苓三萜是茯苓主要有效成分之一，在食品、药品、化妆品等研发生产领域中被广泛运用。因其表现出显著的抗癌、抗炎、降血糖等活性，目前相关研究也多集中在这几个方面，对茯苓三萜消除自由基的研究较少。茯苓三萜为亲脂性成分，易溶于有机溶剂[10]，用甲醇溶出和加热回流、乙酸乙酯加热回流3种方式对茯苓菌丝产物进行提取的不同三萜产物，并进行抗氧化活性研究。

1 材料

1.1 菌株

Poria cocos5.0078，购于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。

1.2 试剂

生物试剂：琼脂，玉米浆粉，维生素C（Vc）；分析纯：葡萄糖，ZnSO4，MnSO4，CuSO4，2-硫代巴比妥，邻二氮菲，FeSO4，30%H2O2，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），KH2PO4，K2HPO4，无水乙醇，甲醇，乙酸乙酯。

1.3 仪器

SN-CJ-2D 型双人净化工作台（上海尚仪设备有限公司），LRH-70 生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），THZ-98C 振荡培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），8L 发酵罐（上海保兴生物），超声波细胞粉碎机（析牛科技）、旋转挥发仪（上海尚仪设备有限公司），紫外可见分光光度计（日本岛津UV-1800），台式酸度计（上海理达），GL-21M 立式高速冷冻离心机（长沙平凡）。

2 方法

2.1 菌种保存与活化

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面保存Poria cocos5.0078 菌种，接种PDA 平板活化，28℃下培养7 d，备用。

2.2 液体菌种制备

将活化后的Poria cocos5.0078 接种到100 mL/250 mL 马铃薯葡萄糖培养基中，28℃、160 r/min 振荡培养7 d。相同培养条件转接1次，培养5 d，备用。

2.3 发酵罐发酵

取6 瓶液体菌种，培养基组成：30 g/L 葡萄糖、7.5 g/L 玉米浆粉、0.03 g/L ZnSO4、0.03 g/L MnSO4、0.03 g/L CuSO4、0.01 g/L 2-硫代巴比妥、初始pH 5，进行分批补料发酵9 d。

2.4 三萜产物提取

甲醇溶出三萜产物：取发酵液200 mL，过滤，菌丝体加甲醇进行破碎，溶出液合并，过滤，滤液浓缩至干粉，备用。

甲醇加热回流得三萜产物：取发酵液200 mL，过滤，菌丝体烘干研磨成细粉，加200 mL 甲醇加热回流1 h，重复提取3次，合并提取液，浓缩得干粉。

乙酸乙酯加热回流得三萜产物：取发酵液200 mL，过滤，菌丝体烘干研磨成细粉，加200 mL乙酸乙酯加热回流1 h，重复提取3次，合并提取液，浓缩得干粉。

2.5 抗氧化活性测定

2.5.1 DPPH消除能力测定

取上述3 种三萜产物各25 mg，甲醇定容5 mL。设置样品不同浓度梯度，各取1 mL 与1 mL 0.1 mmol/L DPPH 混合，30 min 后在517 nm 下测定吸光度值，重复3次。以Vc 为阳性对照，以甲醇为空白对照。式（1）得DPPH 自由基消除率[11–12]。

式中，D1为样品吸光度值；D0为甲醇吸光度值。

2.5.2 H2O2消除能力测定

相同方法制备不同浓度梯度样品适量。另将0.75 mmol/L 邻二氮菲1 mL、150 mmol/mL 磷酸盐缓冲液（pH=7.4）1.5 mL 混合，加入0.75 mmol/L FeSO41 mL 混合，制备7份。分别加不同浓度样品1 mL 及0.01% H2O21 mL，剩余两份均不加样品，一份加0.01% H2O21 mL，一份不加H2O2，这两份分别用甲醇和50%甲醇补足。37℃水浴加热1 h，510 nm 下测定吸光度值，重复3次。以Vc 阳性对照。式（2）得H2O2·自由基消除率[13]。

式中：A0为不加H2O2溶液吸光度值，A1为加H2O2溶液吸光度值，A2为样品溶液吸光度值

3 结果与分析

3.1 DPPH消除能力

茯苓三萜产物对DPPH 的消除能力见表1。以Vc为阳性对照，这三种方式提取的三萜产物对DPPH 均有消除能力，甲醇加热回流的三萜产物比甲醇溶出的三萜产物、乙酸乙酯加热回流的三萜产物的消除能力强；但因三萜产物均是粗提取，三者对DPPH 消除能力均没有Vc 的强。

表1 不同提取方式的茯苓三萜对DPPH的清除能力

3.2 H2O2·消除能力

茯苓三萜产物对H2O2的清除能力见表2。以Vc为阳性对照，这三种方式提取的三萜产物对H2O2均有消除能力，甲醇溶出得三萜产物与甲醇加热回流得三萜产物对H2O2的消除能力接近；相同提取方式，甲醇加热回流的三萜产物比乙酸乙酯加热回流的三萜产物对H2O2的消除能力强；三者对H2O2消除能力均没有Vc的强。