角蛋白7、p53蛋白与膀胱癌临床病理及预后的相关性

杨慧娟,杨淑君,王艳,颜子千

临床研究表明,即使采用各项辅助治疗与根治性手术治疗肌层浸润型膀胱癌(T2～T4期),患者5年生存率仍低于50%[1-2]。研究表明,角蛋白7(KRT7)主要存在于上皮细胞,能够参与细胞间连接的形成,在维持上皮细胞完整性中扮演着重要角色[3]。KRT7主要表达于已分化的尿路上皮细胞、导管上皮细胞,可用于评估膀胱癌预后[4]。p53蛋白能够参与基因组形成、细胞周期调控、细胞程序化死亡、DNA修复合成等多种病理过程,其可用于评估胃癌等多种恶性肿瘤预后[5]。免疫组化法是应用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原,可精确定位所需要的细胞类型或组织区域,有助于研究肿瘤微环境中的病理特征[6]。已有报道指出,免疫组化法可用于检测癌组织中基因蛋白表达情况,有助于分析蛋白表达情况与肿瘤患者临床病理特征的关系[7]。目前,国内尚缺乏有关免疫组化法用于研究KRT7、p53蛋白与膀胱癌临床病理及预后相关性的研究报道,基于此,现分析KRT7、p53蛋白与膀胱癌临床病理及预后的相关性,报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 分析2016年2月—2019年3月江苏省连云港市第二人民医院病理科收治的膀胱癌患者105例的临床资料,男78例,女27例,年龄36～79(56.72±8.25)岁。本研究已经获得医院伦理委员会批准(KY-20190815008-09),患者或家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准:①符合膀胱癌的诊断标准,且均为膀胱尿路上皮癌;②均接受膀胱癌根治术治疗;③术前没有采用任何辅助性治疗;④临床资料完整者;⑤免疫组化中KRT7蛋白与p53蛋白均强表达。(2)排除标准:①合并其他泌尿系统疾病;②合并其他类型恶性肿瘤者;③术前发生远处转移者;④伴有免疫缺陷性疾病;⑤重要脏器严重功能障碍。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 组织取材:患者均接受膀胱癌根治术,确保术中所切取的组织包括癌旁组织(距离肿瘤组织>3 cm)与癌组织准确并于病理科检测。术后根据患者个人情况实施放疗、化疗等。

1.3.2 KRT7蛋白与p53蛋白检测:癌旁组织与癌组织均经包埋处理后,连续切取5片,苏木精浅染,自来水冲洗,二甲苯脱蜡。分别用75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇实施梯度洗脱,加入鼠抗人KRT7单克隆抗体、鼠抗人p53单克隆抗体(均购自上海圻明生物科技有限公司)。4℃条件下孵育过夜,磷酸盐缓冲液冲洗2～3次,加入羊抗鼠二抗(购自上海圻明生物科技有限公司),25℃条件下孵育24 h,二氨基联苯胺显色,苏木素复染,中性树胶封固。显微镜观察组织切片,评估KRT7蛋白和p53蛋白在组织中的表达情况。

结果判读:KRT7蛋白、p53蛋白阳性染色为细胞浆呈黄色或棕黄色。细胞染色强度按照无色、浅黄色、棕黄色、棕褐色分别记为0分、1分、2分、3分;按阳性细胞百分比<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分别记为0分、1分、2分、3分、4分,染色指数(阳性细胞百分比评分×细胞染色强度)0分为KRT7蛋白、p53蛋白阴性,否则记为阳性。

1.3.3 随访及预后:随访3年,每3个月随访1次,以电话、微信等形式进行随访,以患者死亡或随访时间截止(2022年3月)记为随访终点。

2 结 果

2.1 p53蛋白、KRT7蛋白表达比较 癌组织KRT7蛋白阳性率低于癌旁组织(P<0.01),癌组织p53蛋白阳性率高于癌旁组织(P<0.01),见表1、图1。

图1 癌组织与癌旁组织KRT7、p53蛋白表达情况(免疫组化染色,×200)

表1 癌组织与癌旁组织KRT7蛋白、p53蛋白表达比较 [例(%)]

2.2 癌组织中KRT7蛋白、p53蛋白表达在不同临床病理特征中的差异 T2～T4期、低分化、肿瘤直径≥3 cm患者癌组织中KRT7蛋白阳性率低于、Ta～T1期、中高分化、肿瘤直径<3 cm患者(P<0.05)。T2～T4期、低分化、肿瘤直径≥3 cm患者癌组织中p53蛋白阳性率高于Ta～T1期、中高分化、肿瘤直径<3 cm患者(P<0.01),见表2。

表2 癌组织中KRT7蛋白、p53蛋白表达在不同临床病理特征中的差异 [例(%)]

2.3 膀胱癌患者预后的危险多因素Cox分析 以膀胱癌患者预后为因变量,以上述结果中P<0.05项目为自变量进行Cox分析,结果显示:临床T2～T4期、分化程度低、肿瘤直径≥3 cm、KRT7蛋白阴性、p53蛋白阳性为膀胱癌患者预后的危险因素(P<0.01),见表3。

表3 膀胱癌患者预后的危险多因素Cox分析

2.4 KRT7蛋白、p53蛋白表达与膀胱癌患者存活率的关系分析 随访3年,105例膀胱癌患者失访4例,剩余101例患者中死亡34例(33.66%);KRT7蛋白阳性失访2例,死亡15例,存活率为77.27%(51/66);KRT7蛋白阴性失访2例,死亡19例,存活率为45.71%(16/35),KRT7蛋白阳性患者存活率高于KRT7蛋白阴性患者(χ2=5.238,P=0.022),见图2。p53蛋白阳性失访2例,死亡22例,存活率为62.71%(37/59),p53蛋白阴性失访2例,死亡12例,存活率为71.43%(30/42),p53蛋白阴性存活率高于p53蛋白阳性患者(χ2=5.115,P=0.024),见图3。

图2 膀胱癌组织KRT7蛋白表达与患者3年内生存的关系

图3 膀胱癌组织p53蛋白表达与患者3年内生存的关系

3 讨 论

近年来,膀胱癌的发病率呈逐渐上升的趋势,且逐渐趋于年轻化[8]。目前,大部分膀胱癌患者初诊为非肌层浸润性膀胱癌(Ta～T1期),治疗期间,癌细胞转移与癌症复发是影响膀胱癌患者预后的独立危险因素[9]。相关研究指出,膀胱癌初期病情隐匿,部分患者就诊时已出现远处转移,治疗后转移和复发是患者3年生存率低、预后较差的重要原因[10-11]。故寻找合适的预测因子预测膀胱癌患者预后,有助于临床诊治与改善预后。

本研究中,癌组织KRT7蛋白阳性率低于癌旁组织,癌组织p53蛋白阳性率高于癌旁组织,提示KRT7蛋白与p53蛋白在膀胱癌的发生中发挥着一定作用,与既往研究报道类似[12]。本研究结果显示膀胱癌患者癌组织中KRT7、p53蛋白表达与分化程度、肿瘤直径、临床分期及预后密切相关。本研究中,T2～T4期、低分化、KRT7蛋白阴性、p53蛋白阳性为膀胱癌患者预后的危险因素,进一步证实了KRT7蛋白阴性、p53蛋白阳性与膀胱癌患者预后密切相关,可能原因为KRT7、p53蛋白通过调节机体染色体活性,进而影响膀胱癌患者病情的发生与发展,且临床需重点关注低分化、T2～T4期的膀胱癌患者,及时进行治疗与干预,从而降低预后不良的发生风险。相关研究指出[13],p53蛋白可分为野生型与突变型2种,前者可调控癌细胞的增殖,后者可诱导异常基因的表达,从而促进肿瘤的发生。相关研究表明[14],p53蛋白在膀胱癌中高表达,与临床分期、病理分级等临床病理特征密切相关,在评估膀胱癌预后中具有重要价值,分析原因:p53蛋白在细胞中起着重要的调控作用,包括对DNA损伤的应答和介导细胞凋亡等,在膀胱癌发展过程中,高表达的p53蛋白可能反映了细胞内DNA损伤的积累,并试图通过引发细胞凋亡来抑制肿瘤生长。KRT7可调控基因表达、细胞周期、DNA复制等多种病理过程。肿瘤发生是正常染色体受到多种损伤的结果,包括DNA转录异常、原癌基因的过度激活、抑癌基因的失活等,因此,笔者推测KRT7可能参与了膀胱癌发生的调节。既往研究指出[15],KRT7随着病理分级、肿瘤分期的增加而降低,提示KRT7低表达的膀胱癌患者转移及复发风险更高。本研究中,KRT7蛋白阳性患者生存曲线优于KRT7蛋白阴性患者,p53蛋白阴性患者生存曲线优于p53蛋白阳性患者,进一步证实了KRT7蛋白阴性、p53蛋白阳性患者预后不良风险更高。既往研究表明[16],突变型p53阳性表达率≥30%的肌层浸润性膀胱癌患者总生存时间更短,与本研究结果相符。

综上所述,膀胱癌患者癌组织中KRT7、p53蛋白表达与分化程度、肿瘤直径、临床分期及预后密切相关,且KRT7蛋白阴性、p53蛋白阳性患者预后不良风险更高,但鉴于本研究纳入样本量及随访时间有限,研究结果仍需进一步扩大样本量、增加随访时间来进行验证。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

杨慧娟、杨淑君:设计研究方案,实施研究过程,论文撰写,统计学分析,论文修改;王艳、颜子千:病例收集,数据整理