“pH对酶活性影响”生物学实验的改进与创新

黄茗暄

(华南师范大学生命科学学院 广东广州 510631)

《普通高中生物学课程标准(2017年版2020年修订)》(以下简称《课程标准》)指出,“科学探究”是生物学核心素养的基本组成,教师应贯彻“教学过程重实践”的基本理念,并要求教师通过开展探究性学习活动和工程学任务,培养学生的创新精神。人教版生物学教材《必修1·分子与细胞》第五章第一节中设置了“影响酶活性条件”的探究性实验,旨在加深学生对《课程标准》中重要概念的理解,但学生通过教材中的实验仅能认识到酶在过酸或过碱的环境中会失活,无法准确理解酶活性随pH 变化的曲线图。浙科版和北师大版教材中通过反应小室和量筒实现了酶活性的定量测量,但是不同pH 条件下的酶活性需要分次测量,步骤较为繁琐,无法实现反应的同步化。因此,下文旨在通过改进实验方法和自制简易实验装置,帮助学生理解教材中抽象的数学模型,同时为广大一线教师开展本课教学提供一定的教学参考。

1 分光光度法探究pH 对多酚氧化酶活性的影响

新鲜的猪肝研磨液中过氧化氢酶的活性较高,即使加入少量,分解反应也较为剧烈,因此,仅通过定性观察气泡生成的快慢来判断酶活性的高低,主观性强,易造成较大的实验误差。

教师选用苹果作为实验材料,用分光光度法测定不同pH 条件下苹果中的多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性的变化。学生通过记录同一时间内OD 值的变化数据,构建数学模型,理性认识酶活性随pH 的变化规律。

1.1 实验原理

PPO 是一种金属氧化酶,能催化邻苯二酚产生醌,导致溶液颜色发生变化。用分光光度计在波长420 nm 处进行比色测定,即可计算出PPO 的活力。用不同pH 的缓冲液处理多酚氧化酶液,测定其15 s内OD 值的变化,即可计算出不同pH 条件下多酚氧化酶的活力。

1.2 实验用品及准备

1.2.1 实验用品

紫外可见光分光光度计、匀浆机、水浴锅、pH 试纸、漏斗、滤纸、玻璃棒、试管、1 000 ul 移液枪(管);0.2 mol/L柠檬酸缓冲溶液,0.2 mol/L 磷酸氢二钾缓冲溶液、0.2 mol/L 邻苯二酚溶液(现配现用)、去离子水、新鲜苹果。

1.2.2 实验准备

①PPO 酶液的制备

将苹果切块,按1 g 果肉组织加入10 mL 去离子水的比例将去离子水补足量(在冰浴中操作),低温下匀浆2 min 后过滤,取滤液,制得粗酶液,置冰箱密封保存备用。

②缓冲液的配制

用0.2 mol/L 柠檬酸缓冲溶液与0.2 mol/L 磷酸氢二钾缓冲溶液分别配制pH 为4.0、5.0、6.0、7.0 和8.0 的缓冲液备用。

1.3 实验步骤

和试验管(酶液)进行。用分光光度计在波长420 nm处进行比色测定,记录15 s 内的OD 值变化。

见表1,酶活性测定分为对照管(高温灭活酶液)

表1 pH 对多酚氧化酶活性影响的实验步骤

1.4 实验结果与分析

学生在表1 中记录数据,并以pH 为横坐标﹑以A420(15s)-A420(起始)为纵坐标建立数学模型,用计算机或坐标纸绘制曲线图(图1),并对曲线进行描述与分析。

图1 多酚氧化酶活性随pH 变化的曲线图

1.5 教学建议

(1)教师应介绍分光光度计的原理和使用方法。虽然高中生物学实验没有涉及分光光度计的使用,但是分光光度计可实现高中生物学中部分实验由定性向定量的转变,提升实验的精确度,如双缩脲法测定蛋白质含量。分光光度计也是大学生物学的常用仪器,教师将其应用于高中实验教学,能有效开拓学生的学科视野和提升学生的实验能力,让学生感受到技术发展对科学研究的促进意义。若学校不具备分光光度计等实验仪器,教师可基于多酚氧化酶对pH 变化敏感的特性,引导学生进行颜色观察。教师制作比色卡,规定反应颜色的不同等级,学生利用比色卡对PPO 的活性进行估计。

(2)多酚氧化酶的概念对高中阶段的学生而言较为陌生,可能导致学生难以理解实验原理。此时,教师可以联系生活实际,以苹果暴露于空气中易褐变的生活现象引出PPO 的催化氧化功能。考虑到学生的化学基础,针对邻苯二酚被氧化生成醌的反应,教师只需点明其为氧化还原反应,并指出PPO 催化该反应,导致溶液颜色变深,颜色变化越快,说明多酚氧化酶的活性越高。

(3)在实验准备部分,制备酶液时应尽量减少其暴露在空气中的时间,由于操作要求较高且涉及匀浆机和刀具的使用,因此,酶液的制备建议由实验员完成,学生只需完成表1 相关步骤即可。

(4)用分光光度法测定多酚氧化酶的活性也适合用于探究温度对酶活性的影响、酶的专一性和高效性,教师以PPO 为材料,贯穿“酶的特性”章节教学,一材多用,能够帮助学生构建完整的知识体系。

(5)在课程最后,教师可以鼓励学生为蔬果的保鲜、防褐变等提出有效建议,通过联系生产实践升华知识内容,提升学生的责任意识。

2 同时间测定酶活性的实验装置

在测定酶活性时,各版本教材中采用的实验装置各不相同,浙科版、苏教版和沪科版均用不同的装置对酶活性进行了定量测定,但是均无法实现实验组酶活性的同步测定,且步骤冗杂,现象不够直观。教师设计了如图2所示的实验装置图,该装置既实现了定量测量,又实现了酶促反应的同时发生。教师选用H2O2和猪肝研磨液作为材料,利用物理学中的大气压原理,当松开各试管上端的分止水夹时,H2O2溶液不会注入各试管中,而当松开装置最上端的总止水夹时,各导管中的H2O2溶液同时注入各试管中,从而保证各组实验同时展开。学生通过记录水槽中倒置的量筒内排水的体积,得到实验数据,绘制酶活性变化的曲线图,理解教材中酶活性随pH 变化规律的抛物线。教师帮助学生从简单的定性观察形成感性认知上升为定量实验形成理性认知。

图2 改进实验装置左视图(A)与正视图(B)

2.1 实验用品

铁架台、止水夹、导管、10 mL 试管5 支、橡胶塞、50 mL 量筒5 支、移液枪(管)、水槽;3%过氧化氢溶液(现配现用),20%新鲜肝脏研磨液、pH 为1.0、4.0、7.0、10.0 和13.0 的缓冲液、去离子水等。

2.2 实验步骤

学生分组实验,根据表2 步骤进行pH对酶活性的影响探究。

表2 pH 对过氧化氢酶活性影响的实验步骤

2.3 实验结果与分析

学生在表2 中记录数据,并以pH 为横坐标﹑以量筒内排水的体积(mL)为纵坐标建立数学模型,用计算机或坐标纸绘制曲线图(图3),并对曲线进行描述与分析。

图3 过氧化氢酶活性随pH 变化的曲线图

2.4 教学建议

(1)本实验是综合运用多种学科知识解决问题的良好的跨学科教学素材,实验做出的改进是培养学生关注多元问题,将酶活性相关实验中的生物学知识与化学、物理、数学等其他学科的已有知识联系起来,符合奥苏伯尔的有意义学习理论。实验过程中,教师可给予启发性的引导材料,学生可以自主设计实验装置,下文展示了教师启发学生的主要过程。①教师按照人教版实验步骤,以视频或动手实验的方式让学生了解或完成实验,并向学生提出问题:你在实验过程中发现了什么问题?是否有更为精确的方法测定过氧化氢酶的活性?②教师提供联系初中化学知识的相关材料,如过氧化氢分解制备氧气的实验原理和实验装置(图4),从而启发学生,并设置问题串:是否可以改进这个装置实现定量测定?如何使集气管内不可见的气体可视化?如何测定集气瓶内气体的体积?③教师提供联系初中物理知识的相关材料,如密封容器内外大气压平衡原理以及瓶子扎孔不漏水的小实验,并引导学生思考:如何使反应酶液同时注入五支试管中?如何控制酶促反应同时发生和停止?④教师引导学生开展实验,学生记录同一时间内各量筒内排水的体积后,进行数学建模,综合运用数学知识和生物知识对图像进行分析和描述。

图4 过氧化氢分解制备氧气实验装置

(2)教师在实验过程中发现,碱性环境会导致过氧化氢的分解。实验中可能会出现pH 为10.0 的反应试管产生气体的量大于pH 为7.0 的试管的现象。这可能会导致学生误认为,与pH 为7.0 的环境相比,过氧化氢酶的活性在pH 为10.0 的环境中更高,此时,教师可以提供相关材料:过氧化氢是一种代谢废物,猪肝中的过氧化氢酶能够快速分解体内代谢产生的过氧化氢,防止其损害机体,猪肝中的pH 大约为6.8,因此,在功能正常的猪肝脏中,过氧化氢酶的最适pH 为6.8 左右。教师通过材料引起学生的认知冲突,鼓励学生课后自主设计方案并实施来探究碱性环境对过氧化氢分解的影响,并让学生尝试排除碱性环境对过氧化氢酶活性检测的干扰。

(3)为方便学生对量筒内的氧气体积进行准确读数,教师可在水槽中滴加几滴墨水。

(4)本实验装置不仅适于探究pH对酶活性的影响,同样适于探究不同温度下酶活性的高低,以及酶的专一性和高效性,实验装置用途广泛,直观高效。

3 总结与启示

科学探究是生物学核心素养的重要组成,是科学本质教学中的有效策略。在生物学教学过程中,教师应重视教材中有关实验探究的内容,深挖教材,引导学生开展有意义的科学探究活动,帮助学生建立生物学观点,理解科学本质和科学概念。

实验的改进和创新离不开教师的知识沉淀和日积月累的实践经验,同样也离不开学生与生俱来的好奇心,教师要尊重实验过程中学生提出的每一个问题,并与学生共同商讨解决方案,最大限度地挖掘和锻炼学生的质疑精神和实验能力,进而使教学达成科学思维、科学探究等核心素养的培养目标。