糯米面团中金黄色葡萄球菌生长预测模型的构建

冻梓杰，黄阳阳，周伟涛，黄忠民,2,3，艾志录,2,3，郑 琦，王晓杰,2，索 标,2,3,*

（1.河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002；2.农业农村部大宗粮食加工重点实验室，河南 郑州 450002；3.国家速冻米面制品加工技术研发专业中心，速冻面米及调制食品河南省工程实验室，河南 郑州 450002）

食源性致病菌是导致食物中毒的最主要原因[1]，根据世界卫生组织的统计数据，世界上近十分之一的人在食用受污染的食物后患病，每年有数十万人直接或间接死于食源性疾病[2]，因此，由食源性致病菌引起的食源性疾病已成为全球关注的重要问题[3]。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是常见的食源性致病菌且广泛存在于环境中，大多数感染金黄色葡萄球菌的人在感染后6～48 h会出现呕吐、腹泻、恶心、腹部绞痛等症状[4]。前人研究表明，金黄色葡萄球菌广泛分布于米面制品中[5]。糯米面团主要由糯米粉制成，是我国传统米面食品的主要原料之一，随着糯米产品品种的不断多样化及其工业化生产的加速发展，其食用的安全性越来越引起人们的关注[6]，糯米面团的高水分活度是引起微生物增殖的重要原因之一[7]，因此在糯米面团加工制作、贮藏过程中加强致病菌的防控具有重要意义。

微生物生长预测模型可以用来描述在不同环节如食品的加工、运输以及销售等过程中环境条件变化对微生物生长数量的影响[8]，现已被广泛应用于预测食品的货架期、HACCP体系建立以及食品安全风险评估等[9]。Huang Zhongmin等[10]揭示在4～45 ℃条件下，不同金黄色葡萄球菌的生长拟合模型具有较大差异。Park等[11]研究了3～37 ℃条件下蛋黄中金黄色葡萄球菌混合菌悬液的生长动力学，证明采用Baranyi一级模型和Ratkowsky平方根模型可较好地模拟金黄色葡萄球菌在此环境下的生长。Hwang等[12]采用一步动力学分析法构建微生物三级预测模型，描述了蜡样芽孢杆菌在炒饭中的生长和存活情况。然而，目前有关糯米面团中金黄色葡萄球菌的生长模型尚未建立。

本研究通过一级和二级模型描述4～37 ℃条件下金黄色葡萄球菌在糯米面团中的生长规律，并建立其生长动力学模型，以期为糯米面团中金黄色葡萄球菌的风险评估提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糯米粉 益海嘉里食品工业有限公司；BP琼脂平板基础、肉膏蛋白胨肉汤LB、酵母浸粉（yeast extract，YE）、亚碲酸钾卵黄增菌液 北京路桥技术股份有限公司；氯化钠（分析纯）天津市德恩化学试剂有限公司；无菌均质袋 青岛海博生物技术有限公司。

金黄色葡萄球菌ATCC 8095来源于美国典型菌种保藏中心，金黄色葡萄球菌NCTC 8325来源于英国典型菌种保藏中心；菌株均保存于－70 ℃甘油管中。

1.2 仪器与设备

SX-500高压蒸汽灭菌锅 日本Tomy公司；SW-CJ-1FD型洁净工作台 苏州净化有限公司；WS-250恒温恒湿培养箱 上海比朗仪器有限公司；SCIENTZ-09无菌均质器 宁波新芝生物科技股份有限公司；HZQ-A恒温恒湿摇床 苏州威尔实验用品有限公司；5430R型高速台式冷冻离心机 德国Eppendorf公司；MDF-U5412医用低温冰箱 无锡久平仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液的制备

参照Ellouze 等[13]的方法，将金黄色葡萄球菌ATCC 8095和NCTC 8325菌株接种到LB-YE肉汤中，在37 ℃过夜培养至指数后期，并采用0.85 g/100 mL无菌生理盐水清洗3 次，将两种金黄色葡萄球菌等体积混合制备混合母液，得到约108CFU/mL的菌悬液备用。

1.3.2 糯米面团的制备、细菌接种与计数

将糯米粉置于紫外灯下30 min以灭活背景菌群，将糯米粉与无菌水按质量比5∶4混合揉制均匀制成约5 g的糯米面团，并分装在无菌均质袋中，制作全程在无菌操作台下进行。将菌悬液用0.85 g/100 mL无菌生理盐水稀释至约4（lg（CFU/mL）），吸取100 μL稀释后菌液均匀接种至糯米面团表面并密封采样袋。

分别将接种后的糯米面团放置于4、11、18、25、32 ℃和37 ℃的恒温培养箱中贮藏。4 ℃和11 ℃条件下每间隔24 h、18 ℃条件下每间隔12 h、25 ℃条件下每间隔6 h、32 ℃和37 ℃条件下每间隔3 h取出一组进行金黄色葡萄球菌浓度测定，不同温度下测定终止时间以生长达到稳定后期为准。每个样品在无菌条件下加入45 mL的0.85 g/100 mL无菌生理盐水，用无菌均质器以12 次/s拍打2 min。取100 μL梯度稀释液涂布至BP平板，放置在37 ℃恒温培养24 h后进行计数。每个处理至少3 个平行。

1.3.3 糯米面团中金黄色葡萄球菌一级生长模型的建立

分别采用Huang[14]、Baranyi[15]和修正的Gompertz模型[16]作为一级生长模型拟合各温度下糯米面团中金黄色葡萄球菌生长曲线。其中Huang模型如式（1）、（2）所示，Baranyi模型如式（3）、（4）所示，修正的Gompertz模型如式（5）所示：

式中：Y（t）为t时刻金黄色葡萄球菌的数量（lg（CFU/g））；Y0、Ymax为初始菌数量和稳定期菌数量（lg（CFU/g））；μmax为最大比生长速率/h－1；t为培养时间/h；λ为延滞时间/h；h0为反应细菌所处的生理状态[17]，h0＝λμmax；α为常数（α=4）。

1.3.4 二级模型的建立

分别使用Ratkowsky平方根模型[18]和Huang平方根模型[19]构建二级模型，用以评价温度对糯米面团中金黄色葡萄球菌生长速率的影响，Ratkowsky和Huang模型计算如式（6）、（7）所示：

式中：Tmin和Tmax分别为微生物最低、最高生长温度/℃；T0为最低生长温度/℃；T为培养温度/℃；μmax为生长速率/h－1。

1.3.5 模型的外部验证

金黄色葡萄球菌在20 ℃左右时生长较为平缓，且糯米制品在加工过程中环境温度大约为20 ℃，可较好地作为生长预测模型外部验证的验证温度[20]，因此本研究额外开展20 ℃恒温条件下糯米面团中金黄色葡萄球菌生长实验，收集生长数据；并将实测值与模型预测值进行比较以确认模型的拟合度。

1.4 数据分析

本研究使用Microsoft Excel 2019进行数据统计和处理，采用预测微生物学软件IPMP 2013和Origin 2019作图并分析，对糯米面团中金黄色葡萄球菌的生长数据进行拟合处理。利用Origin 2019软件，绘制一、二级模型并进行分析。

2 结果与分析

2.1 糯米面团中金黄色葡萄球菌一级生长模型的建立

为研究温度对糯米面团中金黄色葡萄球菌生长的影响，选用4、11、18、25、32 ℃和37 ℃温度节点，分别使用Huang模型、Baranyi模型、修正的Gompertz模型方程进行非线性拟合，这3 种模型也是目前常用的描述致病菌生物生长的一级模型[21]。各温度下金黄色葡萄球菌生长拟合曲线如图1所示，金黄色葡萄球菌初始浓度为3.9～4.3（lg（CFU/g）），随着贮藏温度的升高，相同时间下细菌浓度逐渐增加。在4 ℃时金黄色葡萄球菌生长速率缓慢，恒温培养7 d（168 h）后，其细菌浓度为4.5（lg（CFU/g）），增加约0.5（lg（CFU/g）），未观察到明显的生长，不能进行一级生长模型的有效拟合（图2）。在11～37 ℃温度区间时糯米面团中金黄色葡萄球菌均能正常生长且进行模型拟合，因此本研究选取此温度阶段下生长数据用于数据分析。

图1 不同温度下糯米面团中金黄色葡萄球菌的一级生长模型Fig.1 Primary models for S.aureus growth prediction in glutinous rice dough at different temperatures

图2 4℃条件下糯米面团中金黄色葡萄球菌的生长曲线Fig.2 Growth curve of S.aureus in glutinous rice dough at 4℃

如图1所示，采用上述3 种一级模型对数据进行拟合后，金黄色葡萄球菌在各温度下（11～37 ℃）的实验实测值均接近相应模型预测值，表明3 个模型均能成功描述样品中细菌的生长情况。各培养温度下糯米面团中金黄色葡萄球菌呈现出典型的3 个生长特征阶段：延滞期、对数期和稳定期；且随着温度的升高，其延滞期总体逐渐降低，细菌生长速率逐渐增加。延滞期的长短取决于多种因素，环境温度对延滞期有显著影响，其规律一般表现为延滞期随着温度的升高而逐渐减少[22]。

2.2 一级模型的比较分析

本实验采用延滞时间（λ）和最大比生长速率（μmax）指标判定微生物生长速率的快慢，用赤池信息准则（akaike information criterion，AIC）、准确因子（Af）、偏差因子（Bf）、均方误差（mean squared error，MSE）、均方根误差（root mean square error，RMSE）以及决定系数（R2）对模型进行评价[23]。其中R2、Af和Bf越趋近于1则代表该模型在此温度下拟合效果越好，AIC、MSE和RMSE越小代表该模型拟合精确度越高[24]。

由表1可知，在11～37 ℃时，Huang模型中金黄色葡萄球菌的μmax随温度的升高由0.044 h－1增加至0.651 h－1，而相对应的λ由14.454 h降低至1.200 h；在Baranyi模型拟合下μmax随温度的升高由0.045 h－1增加至0.708 h－1，λ由16.933 h降低至1.607 h；修正的Gompertz模型中μmax随温度的升高由0.046 h－1增加至0.611 h－1，λ由16.463 h降低至1.083 h。表1中上述3 种一级生长模型（Huang、Baranyi和修正的Gompertz）中AIC、MSE、RMSE和R2较为接近，R2且各模型间参数无明显差异，说明3 种模型对糯米面团中金黄色葡萄球菌的生长曲线均具有较好的拟合精确度。但在低温环境下（11 ℃）和较高环境下（37 ℃）修正的Gompertz模型中AIC和RMSE明显低于其他两种模型、R2系数高于其他两种模型，表明此温度下（11 ℃和37 ℃）糯米面团中金黄色葡萄球菌生长曲线更适合用修正的Gompertz模型进行拟合。在较温和的温度区间（18、25 ℃和32 ℃）内修正的Gompertz模型与其他两种模型间参数无明显差异，均能较好地模拟金黄色葡萄球菌在糯米面团的生长。

表1 不同温度糯米面团中金黄色葡萄球菌的生长动力学参数Table 1 Growth kinetic parameters of S.aureus in glutinous rice dough at different temperatures

修正的Gompertz模型在低温11 ℃和适宜37 ℃条件下表现最佳，此时一级模型参数优于Huang和Baranyi模型，在温和温度（18～32 ℃）下表现良好，3 种一级模型差异并不显著，这可能是因为该范围包括金黄色葡萄球菌理想生长温度[25]，使其生长更具可预测性。本研究和Lu等[26]在熟制米饭中金黄色葡萄球菌的研究结果有所差异，Huang、Baranyi和修正的Gompertz模型均能较好地拟合金黄色葡萄球菌在12～35 ℃条件下的生长，但Huang模型在此条件下的拟合度最佳，这可能与此研究在以大米为基质的前提下加入猪肉松且进行了熟制有关，生长基质的不同可能是导致差异的主要原因。

2.3 糯米面团中金黄色葡萄球菌生长二级模型的比较分析

本研究采用Ratkowsky平方根模型和Huang平方根模型对贮藏温度与生长速率之间的关系进行拟合，二级模型曲线如图3所示。Ratkowsky平方根模型和Huang平方根模型的RMSE分别为0.048和0.051，且Af和Bf均接近1（表2），这表明2 种二级模型适用于描述温度对糯米面团样品中金黄色葡萄球菌生长速率的影响。如表3所示，由Ratkowsky平方根模型拟合金黄色葡萄球菌最低生长温度和最高生长温度分别为0.049 ℃和47.135 ℃，Huang平方根模型拟合结果分别为和4.641 ℃和47.121 ℃，本实验中4 ℃条件下金黄色葡萄球菌仍存在缓慢生长的现象（图2），在168 h内增长了约0.5（lg（CFU/g）），说明Huang平方根模型并不适合描述低温下金黄色葡萄球菌的实际生长情况；Ratkowsky平方根模型的Af和Bf等模型拟合度参数均优于Huang平方根模型，而且Ratkowsky平方根模型与金黄色葡萄球菌的生物学最低生长温度较为吻合，因此本研究建议将其作为糯米面团中金黄色葡萄球菌的二级模型。Xie Zhaopeng等[27]研究表明，乳制品中金黄色葡萄球菌的最低、最佳和最高生长温度分别为5.9、42.0 ℃和49.2 ℃；Valík等[28]证明金黄色葡萄球菌在生牛乳中最低生长温度为4.56 ℃；Lu等[26]在研究中证明Huang平方根模型是拟合金黄色葡萄球菌在熟制米饭中存活的最优二级模型（最低生长温度为7.0～7.9 ℃）；但鉴于微生物生长预测模型的效率因生长基质、环境条件等因素而异，因此有必要对具体条件下的模型拟合情况进行具体分析。本实验为了更好地模拟真实制作的流程，采用了两株金黄色葡萄球菌进行混合培养并接种，前人研究结果中最低生长温度（4～8 ℃）均高于本实验结论（0.049 ℃），不同的生长基质和细菌菌种可能是造成最低生长温度有所差异的重要原因。

表3 糯米面团中金黄色葡萄球菌生长速率的二级模型参数Table 3 Parameters of secondary models for the specific growth rate of S.aureus in glutinous rice dough

图3 2 种二级模型描述温度对糯米面团样品中食源性致病菌生长速率影响的拟合曲线Fig.3 Curve fitting with two secondary models of the effect of temperature on the growth of foodborne pathogens in glutinous rice dough

经过2.2节对3 种一级生长模型拟合度的对比，采用修正的Gompertz模型时，金黄色葡萄球菌λ与培养温度有如图4A所示的对数非线性关系；μmax和λ之间对数线性关系如图4B所示，lnλ与lnμmax呈线性减少关系。

图4 金黄色葡萄球菌生长动力学参数比较Fig.4 Comparison of S.aureus growth kinetic parameters

2.4 模型的外部验证

为了从外部验证修正的Gompertz模型在本研究的拟合准确度，在本研究中未设置的其他温度（20 ℃）下进行了存储实验，并将实验实测值与模型预测值进行更直观比较（图5）。图中点越接近斜线，说明实验值和预测值越接近，即所建立模型的效果越好。经外部模型验证证明，金黄色葡萄球菌在修正的Gompertz模型拟合情况下Af、Bf均小于1.15，且R2＞0.99，表示在此模型拟合下能很好地预测金黄色葡萄球菌的生长规律。

图5 外部实验20℃条件下实验值与预测值的相关性比较Fig.5 Correlation between observed and predicted values in external experiments at 20℃

3 结论

研究了4～37 ℃恒温条件下糯米面团中金黄色葡萄球菌的生长，并使用不同的一级和二级模型描述金黄色葡萄球菌生长受贮藏温度的影响规律。根据一级模型拟合精确度参数对比分析，修正的Gompertz模型可更好地模拟细菌生长；通过对二级模型参数及实际生长情况分析，Ratkowsky平方根模型描述的温度范围较广，且能够更准确地预测最低生长温度（0.049 ℃），因此更适合作为金黄色葡萄球菌的二级模型。修正的Gompertz模型和Ratkowsky平方根模型可用于预测恒温贮藏条件下糯米面团中金黄色葡萄球菌的生长，并评估在糯米加工、贮藏等过程中温度滥用的情况下金黄色葡萄球菌的风险。本研究结果对预测和监控金黄色葡萄球菌在糯米面团的生长繁殖，保证以糯米为基质的食品安全性等方面具有参考价值。