不同表型的利川鸡爪黄连的形态学和生物学活性差异研究

方昕悦, 李 宇, 冉亚兰, 龙入海, 杨永康, 张乔会, 谭生权, 何美军*

(1.湖北省农业科学院中药材研究所/农业农村部中药材生物学与栽培重点实验室/国家中药材产业技术体系恩施综合试验站, 湖北 恩施 445000;2.恩施土家族苗族自治州农业农村局, 湖北 恩施 445000; 3.利川市农业农村局, 湖北 利川 445400;4.恩施土家族苗族自治州农业科学院, 湖北 恩施 445000; 5. 恩施土家族苗族自治州中心医院, 湖北 恩施 445000)

鸡爪黄连为毛茛科植物味连(CoptischinensisFranch)的根茎,形似鸡爪习称鸡爪黄连,是黄连中的名贵品种,湖北省利川市是其主要产地之一[1-2].黄连味苦、性寒,具有燥湿泻火、清热解毒的作用,现代药理学研究表明黄连中的主要活性成分为盐酸小檗碱又称黄连素,具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降血脂等药理活性[3-5].

致病细菌引起的严重感染及其对抗生素的耐药性,已成为制药和医学界面临的最大医疗威胁之一,2019年全球疾病负担数据显示全球约有495万人的死亡与耐药细菌相关(https://www.healthdata.org/research-article/global-burden-bacterial-antimicrobial-resistance-2019-systematic-analysis)[6].虽然抗生素耐药性的产生是一种自然的进化现象,但在人类医学和预防个体疾病的过程中,抗生素的滥用和过度使用加剧了耐药性的产生.鉴于这一严重的全球威胁,世卫组织发出警告,如果不采取行动,任由耐药性的持续增加,到2050年可能会膨胀到每年1 000万人死亡[7].因此,寻找新型抗生素已迫在眉睫,目前从传统中药中寻找合适的联用品或替代品已成为趋势.

自由基是机体新陈代谢产物,当机体氧化防御系统不能清除多余的自由基时或自由基积累过多时会引起细胞氧化损伤,进而引起如肝癌、肝损伤等氧化应激性疾病[8].黄连为中医临床常用药材,由于抑菌效果广泛,素有“中药抗生素”之称[9],且研究发现黄连生物碱[10]、黄连多糖[11]等具有较好的抗氧化活性,是天然抗氧化剂重要来源.随着课题组多年的研究实践发现,鸡爪黄连存在大叶、细叶两种显著且稳定遗传的性状分离,不同性状的黄连产量差异巨大.因此,开展对不同表型黄连的盐酸小檗碱含量、抑菌、抗氧化活性研究,为后期开展鸡爪黄连优质育种和临床用药提供科学依据.

1 材料

1.1 药材与试剂

4年生黄连样品采集于利川市建南镇板坪村黄连药材基地,由湖北省农业科学院中药材研究所何美军副研究员鉴定.盐酸小檗碱标准品国家药品标准物质,购于中国食品药品检定研究所;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)购自阿拉丁试剂公司;乙腈、甲醇,色谱纯,购自美国迈瑞达公司;乙醇,分析纯,购自国药集团;氯化钠,分析纯,武汉市中天化工有限责任公司;酵母提取物、胰蛋白胨(OXOID)均购自生工生物工程股份有限公司.

十二株供试菌种(表1)由中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室鉴定提供.

表1 供试革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)类型

1.2 仪器与设备

C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,安捷伦科技有限公司)、Q5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)、CR-80CO2培养箱(广州市康恒仪器有限公司)、德国SIGMA离心机(希格玛实验室离心机公司)、BC-R208型旋转蒸发仪(上海贝凯生物化工设备有限公司)、酶标仪(北京华安麦科生物技术有限公司)、THZ-B气浴恒温振荡器(常州杰博森仪器有限公司)、HDL超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)、立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)等.

2 方法

2.1 形态差异分析

在基地中随机选取利川黄连大小表型的样品各3 株,测定并记录株高和叶片数、叶柄长度、叶片宽度、叶绿素含量(soil and plant analyzer development, SPAD),单株总生物量、干重,3 次重复.运用SPSS 软件,采用单因素方差统计分析不同表型的黄连性状差异.

2.2 盐酸小檗碱含量HPLC检测;

参考刘洋等[12]方法并改良,黄连样品烘干、粉碎过筛(40目),超声辅助甲醇提取,料液比1∶20,超声功率250 W,超声温度50 °C,提取时间50 min;旋转蒸发浓缩,冷冻干燥成粉末备用.称取盐酸小檗碱标准品5.15 mg,用乙腈溶解,定容至10 mL量瓶中,作为盐酸小檗碱标准品贮备液,浓度为0.515 mg·mL-1.色谱条件:Agilent色谱柱C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A相水溶液(1%乙酸),B相乙腈(1%乙酸);柱温25 °C;检测波长270 nm;流速1 mL·min-1;进样量20 μL.梯度洗脱条件:时间5 →25 min,A相100% →20%;时间25.1 →30 min,A相20% →100%.

2.3 抑菌活性测定

抑菌活性初筛[13]:采用滤纸片法,取200 μL 培养至D(600)=0.6的菌悬液与20 mL LB固体培养基混合均匀倒平板,将无菌滤纸片置于凝固好的混有菌液的固体培养基上.将两种供试药液、氨苄青霉素、二甲基亚砜分别取10 μL滴加于滤纸片(直径为8.00 mm)上,37 ℃恒温培养24 h后测量抑菌圈大小.参照抗生素药敏标准(抑菌圈直径):高敏(≥20 mm)、中敏(10～<20 mm)、轻敏或耐药(0～<10 mm),对其抑菌能力进行判断.

最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)与最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)的测定[14]:将大叶、小叶黄连甲醇提取物用二乘稀释法制成系列浓度梯度的供试药液,在96孔细胞培养板第3～12列的每孔加入含不同浓度的黄连甲醇提取物样品的LB液体培养基100 μL.分别将菌悬液稀释1 000倍,在每孔加入稀释菌液100 μL,37 °C培养18 h后使用HP4500酶标仪检测D(600).第1列为空白培养基对照组,第2列为空白提取物对照组,另设氨苄青霉素96孔板作阳性对照组,根据CLSI M100-S25标准:与阳性生长对照组比较,抑制80%细菌生长的药物浓度为受试菌的MIC值.取200 μL 供试菌液均匀涂布于含有不同药物浓度的平板培养基表面,37 ℃培养24 h,以刚好无菌落生长的浓度为MBC值.

2.4 抗氧化活性测定

取黄连提取物加无水乙醇配制成浓度为100 mg·mL-1的母液,加无水乙醇稀释成浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1的系列待试液,同时运用抗坏血酸作为阳性对照药物,参照彭晓婷等[15]方法,取不同浓度待测液2.0 mL,加入200 μmol·L-1DPPH溶液2.0 mL,摇匀,置于30 ℃水浴锅中避光反应30 min.无水乙醇调零,517 nm处测定D试样.对照组D对照:样品溶液2.0 mL+无水乙醇2.0 mL.D0:2.0 mL DPPH溶液与2.0 mL无水乙醇.不同浓度进行3组重复.清除率计算公式如下:DPPH清除率/%=[1-(D试样-D对照)/D0]×100.运用GraphPad Prism 8对DPPH 自由基清除率结果进行回归分析,计算半数抑制浓度(IC50).

2.5 数据分析

所有实验数据运用SPSS 25.0 软件进行统计分析,实验数据以“平均值±标准偏差”表示.p<0.05,表明具有显著性差异,p<0.01,表明具有极显著性差异.

3 结果与分析

3.1 形态及小檗碱含量差异分析

如图1,黄连大叶植株平均株高31.83±2.66 cm,叶柄长度11.81±1.85 cm,叶片宽 7.46±0.66 cm,叶绿素平均含量(SPAD)为43.41±1.28,鲜重30.47±12.19 g,干重9.07±2.93 g.黄连小叶植株平均株高21.33±1.25 cm、叶柄长度11.81±1.85 cm、叶片宽6.56±0.75 cm,叶绿素平均含量(SPAD)为35.76±1.98,鲜重3.87±0.31 g,干重1.97±0.24 g.HPLC检测大小叶两种表型的盐酸小檗碱的保留时间为16.24 min,含量分别为: 13.3±0.9μg·g-1和41.2±2.24 μg·g-1(图1 b).

a. 大叶黄连(1)与小叶黄连(2)的形态学特征;b.两种黄连的HPLC图

两种表型的黄连(大叶、细叶)的株高、叶柄长度、叶绿素含量、小檗碱含量是具有极显著性差异的,干重和鲜重是具有显著性差异,而叶片数、须根长、叶片宽度不具有显著性差异(表2).

表2 不同表型黄连的形态学差异统计

3.2 抑菌活性测定

滤纸片法显示,大叶黄连甲醇提取物对粪链球菌、藤黄微球菌、苏云金芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、多耐铜绿假单胞菌等七种供试菌有较好的抗菌作用(抑菌圈直径>10 mm),其对应的抑菌圈直径分别为13.48±0.09、10.01±0.33、16.31±0.24、15.06±0.65、14.41±0.29、15.42±0.27、14.24±0.32 mm,但是对粪链球菌、藤黄微球菌的抑菌活性显著低于其他5种供试菌.小叶黄连甲醇提取物对粪链球菌、苏云金芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、多耐铜绿假单胞菌等六种供试菌有较好的抗菌作用(抑菌圈直径>10 mm),其对应的抑菌圈直径分别为12.05±0.15、15.88±0.39、12.07±0.03、11.85±0.4、11.32±0.18、12.39±0.18 mm(图2),且对苏云金芽孢杆菌的抑菌活性显著强于其他5种供试菌.大叶、细叶黄连均显示出对多重耐药菌MRSA强的抑菌活性,但是抗生素拉卡霉素(kan)无抑菌圈显示(图3).

图2 黄连不同表型对12种供试细菌的抗菌作用

图3 抗生素对12种供试细菌的抗菌作用

进一步的MIC值检测,大叶黄连甲醇提取物对粪链球菌、藤黄微球菌、苏云金芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、多耐铜绿假单胞菌等七种供试菌的MIC值分别为3.91、7.81、7.81、7.81、3.91、7.81、7.81 mg·mL-1,显示大叶黄提取物连对粪链球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌活性最强.小叶黄连甲醇提取物对粪链球菌、苏云金芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、多耐铜绿假单胞菌等六种供试菌的MIC值分别为10.94、10.94、21.88、21.88、21.88、21.88 mg·mL-1,显示小叶黄连提取物对粪链球菌和苏云金芽孢杆菌的抗菌活性最强(表3).通过比较两种不同表型的鸡爪黄连抑菌活性,发现大叶黄连对粪链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、多耐铜绿假单胞菌的抑菌活性显著优于小叶黄连;同时大叶黄连对粪链球菌的抑菌活性显著优于卡拉霉素(kan),对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌活性与卡拉霉素没显著差异.

表3 黄连不同表型对12种供试细菌的抗菌作用

3.3 抗氧化活性测定

如图4和图5所示,在浓度0.1～0.8 mg·mL-1浓度范围内,两种表型黄连提取物对DPPH自由基的清除作用均具有线性关系(R≤0.999):大叶黄连y=107.3x+8.436,小叶黄连y=131.2x+15.97;IC50分别为 0.387、0.259 mg·mL-1,利川鸡爪黄连甲醇提取物对DPPH自由基有很好的清除能力,且小叶表型的清除能力优于大叶表型(图4),但两者的DPPH自由基清除能力低于阳性药物抗坏血酸(IC50为 0.072 mg·mL-1,图5).

图4 黄连不同表型抗氧化作用测定结果

图5 抗坏血酸抗氧化作用

4 讨论

黄连是我国传统名贵药材,用药历史悠久.利川是黄连主产区之一,人工种植黄连已有百年历史之久,但由于其生长极其缓慢、品种混杂等问题,关于黄连育种工作困难且报道较少[16].本实验选用的实验材料为利川建南镇培育:4年生大叶鸡爪黄连的平均株高31.83±2.66 cm、叶柄长度15.77±2.05 mm、叶绿素含量43.41±1.28、鲜重30.47±12.19 g、干重9.07±2.93 g;形态学差异显著的4年生小叶鸡爪黄连的株高为21.33±1.25 cm、叶柄长度11.81±1.85 mm、叶绿素含量35.76±1.98、鲜重3.87±0.31 g、干重1.97±0.24 g;小叶鸡爪黄连的盐酸小檗碱含量(41.2±2.24 μg·g-1)显著高于大叶鸡爪黄连(13.3±0.9μg·g-1).

随着抗菌药物的滥用、不合理使用等现象增多,导致包括金黄色葡萄球菌等临床常见致病菌的耐药性增强[17].以黄连为代表的中草药具有一定的抗菌功效,在预防与控制细菌性感染中经常发挥着重要的作用,具有副作用小、来源广、费用低、细菌极少产生耐药性等特点[18],蒋丽施等[19]研究发现味连对金黄色葡萄球菌具有很好的抑制效果,其MIC值为3.125 mg·mL-1,对肺炎克雷伯氏菌的MIC 值在 12.5～25 mg·mL-1的范围.潘彦荣等[20]研究发现黄连提取液对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌功效,抑菌浓度为 0.063 g·mL-1.本研究发现大叶鸡爪黄连对7株供试菌有较好的抑菌作用,MIC值范围为3.91～7.81 mg·mL-1;小叶黄连对6种供试菌有较好的抑菌作用,MIC值范围10.94～21.88 mg·mL-1,鸡爪黄连对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较广抗菌谱.

目前随着自由基和抗氧化剂深入的研究,有关二丁基羟基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)、丁羟基茴香醚(butyl hydroxyanisole,BHA)等人工合成抗氧化剂的生理毒害作用逐渐被报道,天然抗氧化剂的开发和利用越来越受到人们的广泛重视[21].有研究发现肉桂[22]、关黄柏[23]、淫羊藿[24]以及黄连[25]等中草药具有很好的抗氧化活性,可作为天然抗氧化剂的来源.现代药理学研究发现黄连具有抗氧化活性,能抑制体外红细胞的自氧化溶血,提高机体抗氧化能力,减少自由基的毒副作用,减轻肝损伤[26-28].彭晓婷等[14]研究发现黄连及黄连须、黄连茎对DPPH的清除率IC50分别为0.843、0.673、2.097 mg·mL-1.本实验的两种不同表型鸡爪黄连植株均有更强的DPPH自由基清除能力,其IC50值分别为0.387、0.259 mg·mL-1,且表型为小叶的抗氧化活性较大叶的抗氧化活性好,有助于中医药行业的快速发展.