枇杷叶中活性物质提取方法研究进展

林俊豪，闫启东，金昌权，沈林丽，罗士波，徐研菲，吴家泰，王诗怡

（1.台州职业技术学院，医学与制药工程学院，浙江台州 318000； 2.浙江合谱仪器有限公司，浙江台州 318000）

枇杷叶为蔷薇科植物枇杷的叶子，又名巴叶、芦桔叶。枇杷叶中的不同成分具有不同的经济价值，枇杷叶提取物中的活性成分有多种，主要为黄酮类、多糖类化合物和三萜酸[1]。在植物体内黄酮类化合物大多与糖结合生成苷，多糖属于碳水化合物，三萜酸主要有山楂酸、熊果酸等。黄酮类、多糖类化合物均具有抗氧化降血脂作用，三萜酸可以抗疲劳、保肝利尿。上述三种物质对人体健康大有好处，可以延缓人的衰老。枇杷叶还具有较高的药用价值，如调节新陈代谢和内分泌系统，治疗糖尿病[2-3]。此外枇杷叶还可作为食品，如以枇杷叶为原料的复合型果酒[4]。笔者针对枇杷叶中的活性物质及其提取方法进行综述。

1 枇杷叶的提取方法

目前国内外提取枇杷叶中活性物质的方法主要包括：响应面法优化微波辅助提取法[5]、超声波辅助双水相提取法[6]、内部沸腾溶剂提取法[7]、超声波辅助酶提取法[8]、水提醇沉提取法[9]、超临界二氧化碳萃取法[10]等。而活性物质的分析常用高效液相色谱法[11]进行测定。

1.1 响应面法优化微波辅助提取法

响应面法是一种高效且应用广泛的统计方法，即RSM[12]。微波技术普及于1986 年，Gedye 等[13]首次将微波用于有机合成，且该技术在有机合成领域应用广泛。相较于传统溶剂提取法，微波辅助法具有高选择性，可显著提高提取效率，且可用于对热不稳定的物质。利用响应面法结合微波辅助提取，将复杂的实验数据坐标化，具有高效率、无污染的优点[14]。黄百祺等[15]运用响应面法设计试验，测量枇杷叶中熊果酸和齐墩果酸的质量浓度。取粉碎过筛后枇杷叶粉末3.0 g，按照料液比1 g∶20 mL 进行实验，在微波功率为500 W下提取11.5 min，最后得到提取率为0.93%，显示比传统工艺更优。

1.2 超声波辅助双水相提取法

超声波技术具有高效简单的优点，王明艳等[16]将超声波运用于提取枇杷叶中有效成分，采用超声波提取法提取枇杷叶中的多糖，通过多次对比试验得出提取条件对实验的影响程度，依次为超声时间、提取温度、液固比、超声功率。确定最佳实验条件为料液比为1 g∶12 mL，温度为60 ℃，用120 W超声功率超声35 min，得到提取率约为1.24%。与常规水提法对比，该法具有污染小、效率高和提取率高的优点，各项数据全面高于常规水提法，该作者提出可以将超声法与水提法有机结合。双水相提取法能够避免使用有毒试剂，且提供温和的水环境。王丽等[17]利用乙二醇-硫酸铵双水相环境进行探索研究，并绘制了芦丁标准曲线。操作条件：枇杷粉为0.2 g、无水乙醇为4.0 mL、硫酸铵为1.8 g，在料液比为1 g∶50 mL和温度为40 ℃的条件下，提取1 h，得到的提取效率最大，可达7.49%，此方法成本较低。玉澜等[18]运用类似方法进行探索研究，其实验条件为超声功率为270 W，乙醇体积分数为35%，超声温度为40 ℃。运用乙醇与硫酸铵双水相提取，可较大程度提取枇杷叶中的黄酮类化合物。

1.3 内部沸腾溶剂提取法

内部沸腾提取法是传统的提取法，内部沸腾法虽然提取时间较长，但是方法较为环保。内部沸腾法在提取植物有效成分方面具有较好的效果[19]。欧蜀云等[20]用内部沸腾法提取枇杷内的多糖，采用45%的乙醇溶液在98 ℃温度条件下，提取30 min，多糖提取率为6.66%。

1.4 超声波辅助酶提取法

超声波辅助法即超声波法和传统酶解法结合，相较于传统酶解法，超声波可以提高酶解得率。傅贤明等[21]运用超声波辅助酶法提取枇杷叶中的总黄酮，通过绘制芦丁标准曲线计算线性回归方程，再通过比色法，计算总黄酮的含量，并对乙醇浓度、料液比和超声时间等因素进行了探索，得出最佳总黄酮提取条件：料液比为1 g∶40 mL，超声功率为140 W，温度为70 ℃，超声时间30 min，总黄酮提取率为10.53%。

1.5 水提醇沉提取法

水提醇沉法又称为水提醇法，可广泛应用于植物活性物质的提取，如枇杷叶中总黄酮的提取。王增斌等[22]运用水提醇法提取枇杷叶中的总黄酮，料液比为1 g∶20 mL，以90 W超声功率在55 ℃条件下超声40 min，总黄酮提取率约为4.18%。通过单因素实验考察各因素变化对提取率的影响，得到提取条件对枇杷叶中总黄酮提取率的影响程度的大小排序，依次为提取温度、超声波功率、提取时间。

1.6 超临界CO2萃取法

超临界CO2萃取法提取温度较低，可以保护被提取成分，CO2在萃取过程中起到保护样品的作用，使产品纯度更高[23]。张慧恩等[24]运用响应面设计实验法设计实验，探索萃取温度、萃取压力和动态萃取时间三个主要因素对提取率的影响，通过计算超临界CO2提取参数的回归方程，得到提取率。试验条件如下：称取一定量枇杷叶粉末，通入CO2，在萃取温度为61 ℃，萃取压力为25.8 MPa下，动态萃取时间为40 min，熊果酸理论提取率约为3.96 mg/g。

枇杷叶中活性物质通过不同的提取方法提取后，需要一定的分析方法进行分析检测。高效液相色谱法(HPLC)作为高效的分离分析仪器，常作为药用植物活性物质提取物的分析方法[25]。陈荣祥等[26]利用高效液相色谱法检测枇杷中齐墩果酸和熊果酸，对提取溶剂、提取时间、提取温度以及萃取次数等因素进行试验探索。优化的条件为：以体积分数为80%的甲醇水溶液为提取溶剂，提取温度为110 ℃，提取次数为2 次，提取时间每次10 min。以乙腈与15 mmol/L 乙酸铵溶液(pH 9.3)(体积比为3∶1)为流动相等梯度洗脱，流量为0.5 mL/min，检测波长为205 nm，色谱柱温度为40 ℃，测定枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸的含量，得到平均加标回收率分别为95.0%～98.9%和97.3%～100.5%。此分析方法具有分析速度快、操作简单、稳定性高、准确性和重复性好的特点，适用于枇杷叶中齐墩果酸和熊果酸的含量测定。

2 枇杷叶中活性物质

止咳露类药品中多含有枇杷，说明枇杷叶中有止咳成分。同时现代医学研究表明，枇杷叶中含有很多可以入药的成分，可以制作清肺止咳、抗癌、抗炎症的药物[27]；同时枇杷叶中的黄酮类、三萜酸类、有机酸类、挥发油类等化学成分还具有抗氧化、降血糖、抗病毒、护肝的作用[28]。

2.1 黄酮类化合物

枇杷叶中黄酮类成分能够调节人体内的血糖，增强人体免疫力，减缓人的衰老[29]。总黄酮能够清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基，且总黄酮清除DPPH自由基能力与浓度成正比。经过提纯后总黄酮浓度更高，清除DPPH自由基效率更高[30]。梁树才等[31]建立小鼠急性肝损伤模型，观察黄酮化合物(TEL)对肾脏系数的降低作用。超氧化物歧化酶(SOD)生物体内重要的抗氧化酶，其活性越高，清除自由基的速度就越快。枇杷叶的抗氧化活性与总黄酮和总酚含量显著相关[32]，且三倍体叶片总黄酮含量及其对应的抗氧化活性均高于二倍体。付晓丹等[33]对枇杷叶中黄酮提取物进行研究，采用超声波提取法，对枇杷叶各部位的黄酮化合物含量进行测定，结果表明：黄酮化合物在叶尖中含量最高，与其它部位的黄酮化合物含量存在显著差异性。具体测定步骤如下：准备好油脂，往油脂中加入黄酮化合物，再用碘量法测定油脂中的过氧化值，计算出1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的清除率，同时测定2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基的清除率，计算平均值。最终得出抗氧化性与黄酮化合物浓度成正比，且枇杷叶中的黄酮化合物与抗坏血酸有着一定的协同抗氧化作用。

2.2 三萜酸类化合物

三萜酸可以降低神经元的兴奋性，并在癫痫中发挥作用。WEI X等[34]运用高光谱成像法来测定枇杷叶片中三萜酸在枇杷叶各个部位的含量分布，用光谱数据和三萜酸含量建立数据模型，经过一系列处理，得到三萜酸含量分布图。与老年的枇杷叶片相比，幼年的枇杷叶片中三萜酸含量较低，且主要分布在叶肉区域。郭磊等[35]以大鼠作为实验对象，研究三萜酸对慢性支气管炎的疗效，发现注射三萜酸后，大鼠咳嗽次数显著减少，有效抑制了其体内巨噬细胞内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的活性，减少了一氧化氮的释放。

三萜酸类化合物主要有熊果酸、齐墩果酸和山楂酸等，具有抗炎、调节免疫系统和抗肿瘤的作用[36]。葛金芳等[37]用环磷酰胺为原料建立研究小鼠免疫力的模型，同时注射枇杷叶中提取的三萜酸，观察该物质对小鼠细胞免疫的作用，最终得出三萜酸对小鼠细胞免疫具有良好的调节作用，为枇杷叶中的三萜酸应用于临床提供了良好的思路。

2.3 苷类化合物

枇杷叶中的苦杏仁苷与枇杷药理中的祛痰止咳作用相对应[38]。朱月月等[39]研究了止咳枇杷糖浆的止咳效果，采用HPLC 法测定枇杷叶中苦杏仁苷的含量，分析止咳枇杷糖浆中各成分之间的配比，结果发现，止咳糖浆中熊果酸和齐墩果酸占据的比例非常小，两者在制作过程中有大量的损失，苦杏仁苷是发挥主要作用的成分，可以通过控制产品中苦杏仁苷的含量来提高止咳糖浆的质量。

3 总结和展望

枇杷叶中活性物质的提取方法中，超声波双水相提取法是利用超声波产生的空化效应将活性成分提出，再将其在互不相溶的双水相中实现提取和分离[40]。超声波提取的高效率与双水相保护活性成分两个优点相结合就构成了超声波辅助双水相法，该方法具有提取效率高和选择性好的特点。内部沸腾法通过高温使溶液气化而让有效成分大量扩散，较传统水提法效率有所提高[41]。超声波辅助酶解法较传统酶解法提高了酶解得率和提取效率。水提醇沉法应用范围广，操作简单、成本低，且可以较好地保护被提取物[42]。超临界CO2萃取法可用于热稳定性较差的物质，且灵敏度高，测量结果准确，但相对成本高。高效液相色谱法可以作为枇杷叶中活性物质提取常用的分析方法，进行物质的含量测定。

枇杷叶中含有多种活性成分，原料易于采集且成本不高。枇杷叶中活性成分的提取方法，可以广泛应用在各种药用植物的活性物质提取中。在保证良好的选择性和重复性前提下，使用绿色、环保、经济的提取溶剂减少环境污染，提高活性物质提取得率是现代提取方法的发展方向。研究活性成分的提取方法不仅对开发枇杷叶中活性成分药用价值有着重要意义，同时也为其它中药植物的提取开发利用提供了新的思路。