HMGB1-TLR4/RAGE信号通路在呼吸机相关性肺炎中的研究进展

李思琪,王红嫚,秘 乐

(遵义医科大学第五附属医院 呼吸内科,广东 珠海 519000)

呼吸机相关性肺炎(ventilator-associated pneumonia ,VAP)大多数是口咽部分泌物所致感染。气管插管引起的细菌感染和宿主免疫力之间的相互作用在很大程度上决定了VAP的发展。VAP的主要症状包括发热、脓性分泌物、低氧血症、白细胞计数升高［1］。近年来,相关VAP诊疗指南中并未有明确的诊疗标准,通常采用医院获得性肺炎(hospital-acquired pneumonia ,HAP)相类似的诊断标准及治疗方案。区别于上述肺炎,VAP有开创性损伤,在探寻关于VAP诊断及治疗靶点的生物标记物尤为重要。HMGB1在感染和损伤过程中,以炎症反应为媒介,从细胞中释放出来［2］或通过RAGE、Toll样受体介导,激活下游信号,诱导细胞趋化和释放促炎细胞因子等多种细胞反应［3］。

1 呼吸机相关性肺炎定义

在临床上将VAP分为早发型和晚发型,早发型VAP发生于机械通气前4 d内,晚发型VAP发生于机械通气后4 d［4］,其严重性、机械通气时间、ICU住院时长都有相关性,并可能增加死亡风险［5］。开放性创伤是机械通气的常见问题,侵入的病原体主要为吸入型,细菌侵入气管管口后形成细菌生物膜定植于气管导管内,口咽的菌群和定植变化对感染风险都有较大的影响［6-7］。Metersky等［8］提出良好的护理条件：例如抬高床头,每日评估患者状态等来预防感染风险,但在机械通气超过2 d的患者人群中,仍有10%的患者会发展成VAP［9］。

2 HMGB1的结构及作用

高迁移率族蛋白1(high mobility group protein B1,HMGB1)是一类进化的高度保守非组蛋白,因其质量小且在聚丙烯凝胶电泳中的高迁移率而得名。HMGB1是天然免疫细胞分泌的蛋白,由215个氨基酸残基组成,它们形成2个DNA结构域［10］,氨基端含有2个富含赖氨酸带正电荷的 A 盒 和 B 盒 及 1 个酸性氨基酸和高度重复带负电荷的羧基末端,而A盒具有1个肝素结合位点和1个蛋白水解裂位点区［11］,B盒则是为晚期糖基化终产物受体(receptor of the advanced glycosylation end product ,RAGE)结合位区,羧基末端调控HMGB1 与 DNA的结合以及与其他蛋白的相互作用［12］。1994年Matzinger［13］提出了“危险理论”既机体免疫炎症系统不但对感染做出反应,也会对细胞的非生理性死亡和损伤做出反应。然而免疫炎症系统的触发依赖于对内源性危险信号的感知,这些信号统称为损伤相关分子模式(damage-associated-molecular-pattern, DAMP )或警报蛋白。Wang等［14］发现HMGB1是一种具有代表性的 DAMP或警报蛋白,能引起无菌性炎症,它们在机体稳态时,有特定的细胞内指令。但当机体受到外部影响作出应激反应后,HMGB1在接收到相关信号蛋白也会作出相应的反应释放相关炎症因子,从而导致机体全身性炎症感染以及器官损伤甚至死亡。

3 HMGB1与VAP的相关性

VAP的发生机制是多方面的,不仅气管插管引起的开放性损伤打破了上呼吸道的抗菌机械防御系统而且高氧环境的刺激也会增加机体对细菌的易感性。高氧引起活性氧(reactive oxygen species,ROS)及细胞外HMGB1的改变,可影响巨噬细胞吞噬功能［15］。临床研究表明,患者在机械通气后发生肺部炎症及血浆HMGB1升高［16］。DAMP是可通过模式识别受体(pattern recognition receptor PRR)激活先天免疫细胞,而其中晚期糖基化终末产物受体(RAGEs)、toll样受体中TLR2、TLR4和TLR9为HMGB1的常见受体,HMGB1通过与受体结合后激活免疫细胞,如中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞等,从而释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、 白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-γ (TNF-γ)等炎性因子,同时,这些炎性因子又反过来促进HMGB1的分泌,从而启动免疫反应［17］。国内外研究表明,在健康个体中,细胞外HMGB1的释放是激活特异性免疫细胞进行宿主防御作用,而当气管内滴注LPS后,HMGB1呈上升趋势,其致中性粒细胞聚集,细胞因子释放增加,从而导致肺水肿［18］。HMGB1是脓毒症相关性急性肺损伤(acute lung injury, ALI)的晚期介质,且与ALI预后相关［19］,现探寻关于HMGB1/TLR4、RAGE通路在VAP的作用机制,以期针对VAP的诊断与治疗发现新的靶点。

3.1 HMGB1 的释放与JAK/STAT信号通路 蛋白质穿梭于细胞核与细胞质之间的位置,取决于核定位序列(nuclear localization sequence, NLS)和核输出序列(nuclear export sequences, NES),HMGB1中含有2个NLS和2个非经典的NES指导其核定位,可作为判断HMGB1是存在于细胞核或细胞质这一生理条件。HMGB1翻译后修饰可以通过乙酰化、磷酸化、甲基化等多种方式表达。然而,HMGB1定位序列中最普遍的是乙酰化［20］。Janus激酶(JAK)家族由分子(JAK1、JAK2、JAK3、TYK2)组成,其在细胞内信号通路中起重要作用。JAK/STAT1通路受到INF、机械通气等多种因素影响激活,进一步引起HMGB1从胞核到胞浆的移位,HMGB1刺激释放的细胞因子再次激活JAK的磷酸化随之可促进STATs的磷酸化,STATs可以转变为细胞核中调节信号的基本信使,可改变应激或损伤引起的炎症反应［21-22］。Zhang等［23］实验中证实,JAK/STAT信号启动并促进HMGB1的分泌,说明JAK/STAT信号途径能调控HMGB1,使其基因表达发生变化,并且JAK/STAT信号通路抑制剂能逆转这一改变。在HK-2细胞实验中使用siRNA-STAT3转染技术,可知JAK/STAT信号通路的失活降低了HMGB1的表达水平,进一步降低了炎症反应。这些研究结果提示了JAK/STAT信号通路对免疫系统可能具有影响,并且这种影响与JAK/STAT信号通路对HMGB1表达的调控密切相关。

3.2 巨噬细胞极化 机械通气刺激能激活巨噬细胞,活化的巨噬细胞在肺中招募外周中性粒细胞,并参与炎症反应,其中巨噬为主要的驱动力,活化后的巨噬细胞通常分为两类,M1型巨噬细胞及M2型巨噬细胞。Yin等［24］在探讨呼吸机致大鼠肺部炎症的机制时,测定了肺组织巨噬细胞的极化值,结果表明当机械通气频率过高时,大鼠肺内巨噬细胞极化为M1型并分泌TNF-α、IL-6等炎症因子,使炎症反应加剧。在细胞实验中利用shRNA转染技术沉默细胞中的HMGB1发现,HMGB1的沉默可以防止巨噬细胞极化［25］。Wang等［26］研究表明,细胞外HMGB1通过激活巨噬细胞中的黑色素瘤2 (absent in melanoma 2,AIM2)炎性小体及TLR2、TLR4和RAGE/NF-κB等信号通路,可引起M1巨噬细胞的极化。上述实验表明HMGB1参与巨噬细胞的调控。

4 AGE的概述及在VAP中的作用

4.1 RAGE结构 RAGE(the receptor for advanced glycation end products,RAGE)是存在于细胞表面的免疫球蛋白受体,因其可与非酶糖基化和蛋白质、脂质氧化等产物相结合,故被称为晚期糖基化终产物［27］。RAGE蛋白作为PRR中最重要的受体之一,在血管细胞(内皮细胞、平滑肌细胞)以及免疫细胞中均有表达［28］,它能识别并介导不同的信号转导途径,从而参与了许多生理过程,包括炎症反应、氧化应激反应、肿瘤转移等。已有研究揭示RAGE信号通路在糖尿病［29］、阿尔兹海默症［30］、心血管疾病［31］以及癌症［32］均有进展。RAGE信号与细胞的生长、分化、迁移和细胞表面蛋白的表达有一定关系,可以激活多种细胞内信号通路,丝裂原活化的蛋白激酶MAPK(ERK 1/2、p38、SAPK/JNK)、STAT3、Janus激酶,可触发NF-κB、EGR-1和SP-1等信号级联,引起系列促炎基因的表达,包括转录因子下游：血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1 VCAM-1)、IL-6、TNF-α和其他免疫调节剂。

4.2 HMGB1的释放与RAGE/NF-κB 信号通路 Sitapara等［33-34］将小鼠暴露于高氧环境同时给予铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa,PA)感染,刺激巨噬细胞发现,细胞外HMGB1浓度随时间增长呈上升趋势。HMGB1被巨噬细胞视为炎症“警报”的细胞因子输出,巨噬细胞的吞噬功能因此受到影响,同时增加了小鼠的死亡率。呼吸机使用状态下可诱导活性氧刺激抑制性IκB蛋白和磷酸化IκB的激酶,即IκB激酶(IKK)复合体,导致NF-κB的核转位与它们的同源DNA结合,进一步激活关于宿主免疫、炎症、细胞增殖和凋亡相关等多种基因转录。

HMGB1可通过RAGE调节来刺激NF-κB转录因子,进一步促进多种细胞因子(如IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α)的释放。Kircheis等［35］在LPS诱导的ALI模型实验中,模型组RAGE相对空白组浓度显著增加,NF-κB途径的关键蛋白(IKK、IκB和P65)的磷酸化得到高效表达,而在使用蛋白酶抑制剂 VL-01组,使IκBa-α的蛋白酶体降解,同时抑制小鼠IL-1、IL-6、TNF-α、CXCL1等细胞因子在炎症高峰时的表达。Zhou等［36］研究揭示了 LPS 诱导ALI 体外模型中HMGB1-RAGE信号通路的激活,HMGB1的蛋白表达量较空白组升高了3.12倍,同时RAGE和下游p-p65/NF-κB在LPS刺激细胞中的表达也呈上升趋势。另外,动物实验也证明加入抗HMGB1单抗可以降低HMGB1受体(TLR-4、TLR-9和RAGE)以及NF-κB的基因表达水平,并且抑制炎症介质(IL-1b、TNF-α和IL-6)的释放。以上实验结果表明,通过抑制HMGB1/RAGE/NF-κB信号转导通路的激活,可以有效地抑制炎症趋化因子的表达。因此,该通路可作为探究HMGB1在呼吸机相关性肺炎中诊疗指标的新思路［37］。

5 TOLL的概述及在VAP中的作用

5.1 TOLL受体结构 TLR在胞质膜上(TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6)或胞质内囊泡(TLR3、TLR7、TLR8和TLR9)都表达出最重要的受体。其中,TLR4是一种跨膜蛋白,是典型的PRR并在不同的肺细胞内均有表达,其特征是包含有与 MD-2 分子相关的亮氨酸重复序列 (LRR) 的胞外结构域,以及含有保守区域的Toll/IL-1 受体(TIR)结构域［38］。TOLL样受体是病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPS)的结合受体,再经过一系列蛋白质的级联反应激活转录因子,从而引发先天性免疫反应和炎症扩散［39］。TLR4受体可由LPS激活启动MyD88和TRIF依赖性信号通路,并刺激宿主的非特异性免疫应答等,相互作用诱发的局部细胞因子风暴,从而触发炎症反应,可能会引起ALI或更严重的急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),并伴随全身受累和危及生命。已有文献报道,在使用机械通气后,大鼠肺组织中TLR4蛋白的表达量升高,肺毛细血管扩张,肺部炎症细胞增多以及出现肺水肿等病理表现［40］。因此,TOLL受体作为VAP诊断或者治疗的理想靶点有待进一步研究。

5.2 HMGB1的释放与 TLR4-NF-κB 信号通路 在HMGB1结合TLR4的下游信号转导通路诱导炎症细胞因子释放的过程中,TRIF依赖的通路发挥了关键作用。Mohamed等［41］在芳樟醇通过HMGB1/TLR4/NF-κB通路对顺铂肾毒性的改善作用实验中证明,芳樟醇可降低TLR4、MYD88和TRIF mRNA和蛋白的表达,从而减少TNF-α、IL-1β、IL-6和NF-κB、HMBG1相关炎症介质的产生。在大部分骨髓细胞中,CD14大量的表达促进了LPS对TLR4的活化,以及对受体信号传导与降解的调控。TLR4分别触发MYD88依赖通路和TRIF依赖通路,这2条信号通路中衔接蛋白参与促炎因子诱导,且所产生的细胞因子有部分重叠,MyD88和TRIF所依赖的信号通路是被持续触发的,并且与LPS激活的TLR4由胞质到胞核的再分配相关联［42］。Vaneker等［43］在小鼠机械通气试验中证明,TRIF通路是TLR4的下游通路,可以使NF-κB激活,而在TRIF激活引起核因子NF-κB进入细胞核并转录促炎基因,诱导细胞因子的产生,从而发生炎症反应及对肺功能的损害。当TRIF缺乏时激活NF-κB表达量发生下调,可使机械通气后的炎症反应减弱。因此,抑制TLR4/TRIF -NF-κB信号通路介导的HMGB1表达量减少,从而降低相关炎症因子释放以及减轻炎症反应在治疗呼吸机相关性肺炎上具有潜在的价值。

5.3 HMGB1的释放与TLR4-MYD88信号通路 TLR4激活的信号通路作用于TIR结构域招募的配体：MyD88、TIR结构域的接头蛋白(TIRAP),而TIRAP为TLR4激活MyD88的桥梁,参与NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活,并进而调控促炎基因的表达［44］。Zhang等［45］在使用右美托咪定的过程中,可以通过HMGB1-TLR4/MyD88-NF-кB信号通路来缓解心肌缺血/再灌注损伤,实验表明,当受损细胞释放危险信号HMGB1时,受体TLR4结合,启动下游的MyD88-NF-кB信号级通路。Meng等［46］研究表明,TLR4基因敲除或给予TLR4拮抗剂时,NF-кB的表达以及相应的炎性细胞浸润明显减少,提示TLR4-MyD88-NF-кB可能在介导炎症反应中具有潜在作用。Yu等［47］在狼疮性肾炎的实验中给小鼠腹腔注入HMGB1抗体抑制剂8周后,TLR4、MyD88和p-IκBα蛋白的表达下调,所诱导的NF-κB/p65核转位降低,可减轻血管上皮的高通透性,证实细胞外HMGB1在狼疮性肾炎的发病过程中,主要通过活化TLR4/MyD88/NF-κB/p65通路,从而引起肾小管上皮细胞的损伤。在受到机械通气损伤时,组织释放出较多HMGB1激活了TLR4并通过依赖MyD88的途径促进NF-κB的活性,触发IL-1、IL-6和TNF-α等促炎细胞因子的表达,造成组织进一步的损伤［48］,说明抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路以及下游的HMGB1亦可能是成为呼吸机相关性肺炎有价值的临床治疗思路。

6 展望

VAP 是一个具有较高发病率的全球公共卫生问题,HMGB1通过与TLR4/RAGE在VAP中发挥炎症作用,激活下游炎症通路,并引发促炎因子的释放,进一步放大炎症反应,加重了VAP的肺部损伤。然而,HMGB1对呼吸机相关性肺炎影响信号通路的机制仍需更深入探讨。此外,尽管HMGB1-TLR4/RAGE相关拮抗剂在多种炎症模型中取得了进展,但VAP在 临床研究中尚未见到明显成效。本文通过对近年来国内外HMGB1以及相关信号通路和蛋白受体的相互作用关系在VAP诊断治疗中的作用机制进行整理归纳,可能为未来VAP治疗与诊断提供新思路。