普托马尼对利福平依赖结核菌感染小鼠的作用及其机制研究*

蒲冬梅，倪慧敏

（1.成都中医药大学附属医院 药剂科，四川 成都 610072； 2.鹰潭市余江区人民医院药剂科，江西 鹰潭 335000）

结核病是由抗结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis, MTB）感染引起的慢性传染疾病，主要侵犯肺，近年来发病率逐年升高[1]。随着菌株的不断变异、耐药，结核菌逐渐出现了依赖现象，主要表现为在某种药物特定的浓度范围内，结核杆菌生长更快，对该药物具有一定的依赖作用[2-3]。有研究显示，依赖现象中利福平（Rifampicin, RFP）依赖率最高[4]。目前结核杆菌对临床常用药物产生了不同程度的耐药性或依赖性，治疗成功率较低，因此为有效防控结核病，研发疗效显著、安全性高的新型抗结核药物意义重大[5]。普托马尼（Pretomanid, PA-824）是硝基咪唑类的一种，对MTB 有较高的特异性，对抗结核有自己独特的作用机制[6-7]。目前国内关于该药物的临床数据较少，本研究通过复制RFP依赖结核菌感染小鼠模型，探究PA-824 对RFP 依赖结核菌的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级、6～8 周龄Balb/c 雄性小鼠32 只，体重18～23 g，平均（20±2）g，购自上海上药第一生化药业有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2021-0005，实验动物使用许可证号：SYXK（川）2019-049。结核分枝杆菌RFP 依赖株购自北京结核病防治所。

1.2 主要试剂与仪器

RFP（国药准字H13024622，北京中新药业股份有限公司，规格：0.15 g），普托马尼（美国Tb Alliance公司，剂量：0.2 g），苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（安徽雷根生物技术有限公司）。

罗氏培养基（上海卡迈舒生物科技有限公司）。轮转式切片机（型号：S700A，深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型复制及分组 将结核分枝杆菌RFP 依赖株于改良罗氏培养基培养4 周后挑取完整菌落，充分研磨成匀浆后进行比浊，制成浓度1 mg/mL 的菌悬液，采用滤膜（孔径8 μm）过滤后，置于-70 ℃环境下保存，采用活菌计数法计算1 mL 菌悬液中的菌数。将菌悬液室温解冻，进行梯度稀释，根据菌数配置成1×106CFU/mL 的溶液，每只小鼠尾静脉注射0.2 mL，复制RFP 依赖结核病小鼠模型[8]。

将32 只小鼠随机分为4 组：RFP 治疗组、PA-824 治疗组、联合治疗组及对照组，每组8 只。RFP治疗组给予RFP 65 mg/（kg·d），PA-824 治疗组给予PA-824 25 mg/（kg·d），联合治疗组给予RFP 65 mg/（kg·d）和PA-824 25 mg/（kg·d）[9]。对照组给予等量生理盐水，每周采取灌胃的方式给药2 次，治疗6 周，每日观察并记录小鼠的生理状况。

1.3.2 脾、肺组织重量 给药第43 天，每组取4 只小鼠，称重后处死，在无菌环境下解剖，取小鼠肺、脾组织，用电子天平进行称重，记录脾、肺组织重量。

1.3.3 脏器致病指数评分 肺、脾称重后，肉眼观察小鼠脏器病变程度，采用单盲法根据小鼠脏器致病指数评分标准[10]。评分细则见表1。

1.3.4 肺组织RFP 依赖性 称重后取左肺于研磨器中研磨至匀浆，进行10 倍梯度稀释（1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5），每组分别取上述浓度于匡氏培养基在36.5 ℃环境下培养，每周观察菌株RFP 依赖性，3 周后进行菌落计数。

1.4 HE染色观察肺组织病理学变化

治疗结束后，将剩余小鼠全部处死，在无菌环境下解剖，取小鼠肺组织，置于10%中性甲醛溶液中脱水，石蜡包埋，切片，HE 染色，在显微镜下观察每组小鼠肺组织病理学变化，并估算病变部分在切片中的占比。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，两两比较用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肺、脾组织重量比较

对照组、联合治疗组、RFP 治疗组、PA-824 治疗组肺、脾组织重量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，RFP 治疗组肺、脾组织重量升高，PA-824 治疗组和联合治疗组的肺、脾重量降低（P＜0.05）；与联合治疗组比较，RFP 治疗组和PA-824 治疗组的肺、脾组织重量升高（P＜0.05）；与RFP 治疗组比较，PA-824 治疗组的肺、脾组织重量降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组小鼠肺、脾组织重量比较 （n =4，g，±s）

表2 各组小鼠肺、脾组织重量比较 （n =4，g，±s）

注 ： ①与对照组比较，P ＜0.05 ；②与联合治疗组比较，P ＜0.05；③与RFP治疗组比较，P ＜0.05。

脾组织重量0.219±0.033 0.121±0.025①0.286±0.035①②0.179±0.020①②③23.327 0.000组别对照组联合治疗组RFP治疗组PA-824治疗组F值P值肺组织重量0.284±0.022 0.195±0.047①0.353±0.035①②0.241±0.024①②③17.612 0.000

2.2 各组小鼠脏器致病指数评分比较

对照组、联合治疗组、RFP 治疗组、PA-824 治疗组脏器致病指数评分分别为（61.12±15.08）、（26.84±6.26）、（57.06±13.37）、（40.76±10.35）分，经方差分析，差异有统计学意义（F=7.189，P=0.005）。与对照组比较，PA-824 治疗组和联合治疗组脏器致病指数评分降低（P＜0.05）；与联合治疗组比较，RFP治疗组、PA-824 治疗组脏器致病指数评分升高（P＜0.05）；与RFP 治疗组比较，PA-824 治疗组脏器致病指数评分降低（P＜0.05）。

2.3 各组小鼠肺组织菌株RFP依赖性比较

对照组、联合治疗组、RFP 治疗组、PA-824 治疗组脾、肺菌量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，RFP 治疗组脾、肺菌量均增多，PA-824 治疗组和联合治疗组脾、肺菌量均减少（P＜0.05）；与联合治疗组比较，RFP 治疗组和PA-824 治疗组脾、肺菌量均升高（P＜0.05）；与RFP治疗组比较，PA-824 治疗组脾、肺菌量均减少（P＜0.05）。见表3 和图1。

表3 各组小鼠肺组织菌株RFP依赖性比较（n =4，lg CFU，±s）

注 ： ①与对照组比较，P ＜0.05； ②与联合治疗组比较，P ＜0.05；③与RFP治疗组比较，P ＜0.05。

肺菌量4.88±0.27 4.25±0.14①6.25±0.44①②4.49±0.11①②③42.840 0.000组别对照组联合治疗组RFP治疗组PA-824治疗组F 值P 值脾菌量3.19±0.17 2.62±0.17①4.06±0.45①②2.87±0.11①②③23.184 0.000

2.4 各组小鼠肺组织病理学变化

对照组小鼠肺组织出现大范围渗出性病变，程度严重，肺泡组织明显遭到破坏，肺泡腔中性粒细胞、蛋白液大量渗出，部分病灶出现局部干酪样坏死，病变范围约为80%；RFP 治疗组小鼠肺组织同样有大量渗出性病变，局部伴有干酪样坏死，但部分病灶部位为肉芽肿病变，病变范围为70%～80%。经PA-824 治疗后，小鼠肺组织部分病变，渗出性病变明显减少，以肉芽肿性病变为主，病变范围为30%～50%；联合治疗组病理学改变同PA-824 治疗组，病变范围约为20%。见图2。

图2 各组小鼠肺组织病理切片 （HE染色×200）

3 讨论

随着对结核菌的深入了解，多数临床上的结核菌株对RFP、异烟肼等药物具有一定的依赖性，即在一定浓度范围内更利于结核菌的生长[11-12]。

PA-824 是一种新型抗结核药物，该药物在国外已得到证实，能够有效抑制MTB 的活性，同时具有良好的安全性[13-14]。该药物具有独特的作用机制，抑制甲氧基和酮基分枝菌酸，两者均为MTB 细胞壁脂质的组成成分，通过抑制MTB 细胞壁合成，阻断MTB 繁殖，从而达到抑菌的作用[15-16]。目前国内关于PA-824 对MTB 的抑菌作用研究较少。本研究结果显示，RFP 治疗组脾、肺组织重量、荷菌量明显高于对照组，脏器致病指数低于对照组，表明RFP 对MTB 菌株无明显治疗作用，同时有利于MTB 的生长，显示该菌株对RFP 有明显的依赖性。本研究结果显示，单独PA-824 治疗与联合治疗可有效减轻脾、肺组织重量，对小鼠脾、肺荷菌量均有一定的抑制作用，同时能够提高脏器致病指数，说明PA-824在抑制MTB 对RFP 依赖性的同时，具有较好的抑菌作用，同时能够改善脏器病变程度。但对于RFP 依赖性的抑制程度目前尚无明确定论。

结核病的病理变化一般包括坏死性病变、渗出性病变及增生性病变3 种类型[17]。增生性病变一般发生于细胞免疫较强、细菌含量较低的情况，出现细胞聚集现象；渗出性病变则发生于病灶恶化或处于炎症早期，出现水肿、白细胞浸润等现象。本研究中小鼠肺组织病理结果显示，对照组与RFP 治疗组小鼠肺组织病变范围相差较小，同样以渗出性病变为主，局部出现坏死性病变，表明RFP 对RFP 依赖结核菌感染的小鼠治疗无效。PA-824 治疗组和联合治疗组的病变组织渗出性病变明显减少，以肉芽肿性病变为主，联合治疗组的病变组织范围略低于PA-824 治疗组，但对于肺组织病变情况均有很好的改善作用，病变范围明显缩小，病变类型由渗出性病变改善为增生性病变，提示PA-824 对改善病变范围和病变程度有一定的效果。目前PA-824 通过有限人群路径已在美国上市[18]。但该药物仍缺乏临床研究数据，未来需进一步扩大样本量，对PA-824的最佳有效浓度、安全性、耐药机制及最佳联合治疗方案进行深入研究。

综上所述，PA-824 在抑制MTB 对RFP 依赖性的同时，对RFP 依赖结核菌感染小鼠具有较好的抑菌作用，同时对改善病变范围和病变程度有一定的效果，对RFP 依赖结核病的防治具有重要意义。