LncRNA FAM83A-AS1通过miR-150/HMGA2轴对视网膜母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响

周小平 彭正武 陈书扬 刘茹 田涛 欧玉仑

郴州市第一人民医院眼科（湖南郴州 423000）

视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）是儿童最常见的原发性眼内恶性肿瘤，视网膜母细胞瘤基因（Rb1）的丢失或突变可导致视网膜母细胞瘤的发生［1］。RB 的治疗包括局部靶向治疗、放射治疗和化学疗法。尽管有多种治疗选择，但其具有一定的副作用和并发症，包括多药耐药和化疗不敏感，严重影响治疗效果［2］。因此，明确RB 发展的基本机制，探索RB 治疗的生物标志物和新靶点是当务之急。长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一类长度超过200 nt，没有蛋白质编码功能的转录本。大量研究［3-4］证实，lncRNAs参与多种生物学过程的调控，包括细胞增殖、凋亡、转移和基因组稳定性。近年来的研究［5］表明，lncRNAs的异常表达与RB的发生发展有关。例如，lncRNA H19 通过竞争性结合miR-17-92 抑制RB 细胞增殖，诱导细胞凋亡。LncRNA HOXA11-AS通过海绵化miR-506-3p 增强Rb 进程［6］。最近的一项研究［7］发现lncRNA 序列相似家族83 成员A-反义核糖核酸1（family with sequence similarity 83 member A antisense RNA 1，FAM83A-AS1）作为致癌基因，促进肺腺癌的进展。然而，FAM83A-AS1 在RB 癌变过程中的生物学功能及潜在的分子机制尚未明确。miRNAs 是研究最广泛的非编码RNA，可以直接与lncRNAs 相互作用并调节细胞过程，包括个体发育、机体代谢和肿瘤发生。研究发现，FAM83A-AS1 通过调控miRNA 在许多肿瘤细胞中发挥致癌作用。例如，FAM83A-AS1 通过靶向miR-150 促进肺腺癌细胞的迁移和侵袭［8］。然而，RB 中FAM83A-AS1 与miR-150 之间的相关性尚不清楚。因此，本研究旨在探讨lncRNA FAM83AAS1 在RB 进展中的作用及其潜在的分子机制，研究经本院伦理委员会审核通过。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器人视网膜母细胞瘤细胞（SORB50 和HXO-RB44）和人正常视网膜上皮细胞（ARPE-19）均购自中国科学院上海细胞库；MTT试剂盒、双荧光素酶报告基因试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ购自日本TaKaRa 公司；miRNA 荧光定量RT-PCR检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；高迁移率族蛋白A2（high-mobility group protein A2，HMGA2）抗体购自美国Abcam 公司；Annexin VFITC/PI双染试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；Vector、pcDNA-FAM83A-AS1、NC-siRNA、FAM83AAS1-siRNA、NC mimic、miR-150 mimic 质粒均购自上海吉玛制药技术有限公司。多功能酶标仪购自德国BMG LABTECH 公司；7300 型实时荧光定量PCR 仪购自美国ABI 公司；流式细胞仪购自德国PARTEC 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与转染将人视网膜母细胞瘤细胞（SO-RB50、HXO-RB44和Y79）和人正常视网膜上皮细胞（ARPE-19）在含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和0.1 mg/mL 链霉素的RPMI-1640 培养基中培养，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中。将SO-RB50细胞（1 × 105）接种至6 孔板中，当细胞融合度达到80%时，根据制造商的说明书使用Lipofectamine 2000 试剂将Vector、pcDNA-FAM83A-AS1、NCsiRNA、FAM83A-AS1-siRNA、AM83A-AS1-siRNA+NC inhibitor、FAM83A-AS1-siRNA+miR-150 inhibitor、NC mimic、miR-150 mimic、miR-150 mimic+Vector、miR-150 mimic+pcDNA-HMGA2 分别转染至SO-RB50 细胞中。转染48 h 后，收集细胞进行后续实验。

1.2.2 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）实验使用Trizol 试剂从细胞中提取总RNA。随后使用PrimeScript RT 试剂盒将mRNA、lncRNA 逆转录为cDNA，使用miRNA cDNA 第一链合成试剂盒将miRNA 逆转录为cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ或miRNA 荧光定量RT-PCR 检测试剂盒在7300型实时荧光定量PCR 系统中进行PCR 反应以检测mRNA、lncRNA 或miRNA 的相对表达。反应条件为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 min，共40 个循环。GAPDH 用作检测mRNA 和lncRNA的内部对照，U6 用作检测miRNA 的内部对照。根据2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

1.2.3 MTT 实验使用MTT 试剂盒检测细胞增殖能力。将转染后的细胞置于96 孔板中常规培养，24 h 后每孔加入10 μL MTT 溶液并孵育4 h。PBS 冲洗后，每孔加入100 μL DMSO 溶液，静置2 h。最后使用酶标仪测量在450 nm 波长处的吸光度（A）值。

1.2.4 流式细胞术使用Annexin V-FITC/PI 双染试剂盒检测细胞凋亡。首先用预冷PBS 冲洗处理过的细胞，悬浮在密度为1 × 106个细胞/mL 的结合缓冲液中。将100 μL 细胞悬液转移至5 mL 离心管中，并与5 μL Annexin V 和10 μL PI 避光孵育15 min。最后，在流式细胞仪上检测细胞凋亡率。

1.2.5 Western blot使用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解处理后的细胞提取总蛋白。然后用10% SDS-PAGE 凝胶电泳分离等量的蛋白质样品并转移到PVDF 膜上。PVDF 膜在室温下用5%脱脂牛奶封闭1 h 后，与一抗在4 ℃下孵育过夜。随后，加入相应的二抗并在室温下孵育1 h。使用增强化学发光法将蛋白条带可视化。GAPDH 用作检测蛋白质表达的内部对照。

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验使用双荧光素酶报告基因实验验证FAM83A-AS1和miR-150以及miR-150 和HMGA2 之间的靶向关系。将FAM83AAS1 或HMGA2 的野生型（WT）或突变型（MUT）3'-UTR 分别克隆到荧光素酶载体pGL3 中。接下来，通过Lipofectamine 2000 转染试剂将荧光素酶载体和miR-150 mimic/NC mimic 共转染到细胞中，培养48 h。最后，收集细胞，使用双荧光素酶报告基因试剂盒在酶标仪上检测荧光素酶活性。

1.3 统计学方法使用SPSS 21.0 软件进行统计分析。所有数据以均数±标准差表示。数据采用Studentt检验或单因素方差分析进行显著性检验。以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FAM83A-AS1 在RB 细胞系中的表达RTqPCR 结果显示，FAM83A-AS1 在人视网膜母细胞瘤细胞（SO-RB50、HXO-RB44 和Y79）和人正常视网膜上皮细胞（ARPE-19）中的表达分别为（2.85 ±0.21）、（3.07 ± 0.27）、（3.54 ± 0.32）和（1.00 ± 0.09），与人正常视网膜上皮细胞（ARPE-19）比较，人视网膜母细胞瘤细胞（SO-RB50、HXO-RB44 和Y79）中FAM83A-AS1的表达均显著升高（t= 14.043、12.598、13.235，P＜ 0.05），并且在Y79 细胞中FAM83A-AS1表达水平最高。因此，本研究选择Y79 细胞系进行后续实验（图1）。

图1 FAM83A-AS1 在RB 细胞系中的表达Fig.1 Expression of FAM83A-AS1 in RB cell line

2.2 过表达或敲低FAM83A-AS1对RB细胞增殖和凋亡的影响RT-qPCR结果显示，pcDNA-FAM83AAS1 组细胞中FAM83A-AS1 的表达显著高于Vector组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。FAM83A-AS1-siRNA 组细胞中FAM83A-AS1 的表达显著低于NC-siRNA 组，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。MTT实验和流式细胞术结果显示，与Vector 组比较，pcDNA-FAM83A-AS1 组细胞增殖能力显著升高，细胞凋亡率显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与NC-siRNA组比较，FAM83A-AS1-siRNA 组细胞增殖能力显著降低，细胞凋亡率显著升高，差异均有统计学意义（P＜ 0.05，表1）。

表1 各组细胞中FAM83A-AS1 水平、细胞增生值和细胞凋亡率的比较Tab.1 Comparison of FAM83A-AS1， cell proliferation value and cell apoptosis rate in each group ±s

表1 各组细胞中FAM83A-AS1 水平、细胞增生值和细胞凋亡率的比较Tab.1 Comparison of FAM83A-AS1， cell proliferation value and cell apoptosis rate in each group ±s

注：与Vector组比较，aP ＜ 0.05；与NC-siRNA组比较，bP ＜ 0.05

组别Vector组pcDNA-FAM83A-AS1组NC-siRNA组FAM83A-AS1-siRNA组F值P值凋亡率（%）12.53 ± 1.14 6.04 ± 0.52a 11.28 ± 1.37 26.15 ± 2.08b 113.487＜ 0.05例数3 3 3 3 FAM83A-AS1 1.00 ± 0.08 3.11 ± 0.29a 0.98 ± 0.09 0.45 ± 0.04b 166.151＜ 0.05细胞增生值（A）0.58 ± 0.05 0.87 ± 0.07a 0.61 ± 0.04 0.29 ± 0.03b 68.232＜ 0.05

2.3 FAM83A-AS1靶向并调控miR-150的表达双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-150 过表达降低了WT-FAM83A-AS1 的荧光素酶活性（t=10.262，P＜ 0.05），但其对MUT-FAM83A-AS1 荧光素酶活性没有影响（t= 0.287，P＞0.05）。pcDNAFAM83A-AS1 组细胞中miR-150 的表达显著低于Vector 组，差异有统计学意义（t= 10.904，P＜ 0.05，图2）。

图2 FAM83A-AS1 靶向并调控miR-150 的表达Fig.2 FAM83A-AS1 targets and regulates the expression of miR-150

2.4 FAM83A-AS1通过靶向miR-150对RB细胞增殖和凋亡的影响与NC-siRNA 组比较，FAM83AAS1-siRNA 组RB 细胞中miR-150 水平显著升高，细胞增殖能力显著降低，细胞凋亡率显著升高；与FAM83A-AS1-siRNA+NC inhibitor 组比较，FAM83AAS1-siRNA+miR-150 inhibitor 组RB 细胞中miR-150水平显著降低，细胞增殖能力显著升高，细胞凋亡率显著降低，差异均有统计学意义（P＜ 0.05，表2）。

表2 各组细胞中miR-150 水平、细胞增生值和细胞凋亡率的比较Tab.2 Comparison of miR-150 level， cell proliferation value and cell apoptosis rate in each group ±s

表2 各组细胞中miR-150 水平、细胞增生值和细胞凋亡率的比较Tab.2 Comparison of miR-150 level， cell proliferation value and cell apoptosis rate in each group ±s

注：与NC-siRNA组比较，aP ＜ 0.05；与FAM83A-AS1-siRNA+NC inhibitor组比较，bP ＜ 0.05

组别NC-siRNA组FAM83A-AS1-siRNA组FAM83A-AS1-siRNA+NC inhibitor组FAM83A-AS1-siRNA+miR-150 inhibitor组F值P值凋亡率（%）9.06 ± 0.61 21.43 ± 1.82a 20.11 ± 1.63 11.56 ± 0.96b 62.457＜ 0.05例数3 3 3 3 miR-150 1.00 ± 0.08 3.06 ± 0.26a 3.14 ± 0.33 1.58 ± 0.14b 44.689＜ 0.05细胞增生值（A）0.66 ± 0.06 0.29 ± 0.03a 0.32 ± 0.04 0.51 ± 0.05b 27.501＜ 0.05

2.5 miR-150 靶向并调控HMGA2 的表达通过生物信息学软件预测miR-150 和HMGA2 之间的结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-150 mimic 显著降低了WT-HMGA2 的荧光素酶活性（t= 9.488，P＜ 0.05），但其对MUT-HMGA2荧光素酶活性没有影响（t= 0.405，P＞0.05）。miR-150 mimic 组细胞中HMGA2 mRNA 水平的表达均显著低于NC mimic 组，差异均有统计学意义（t= 12.199，P＜ 0.05）。miR-150 inhibitor 组细胞中HMGA2 mRNA水平的表达均显著高于NC inhibitor组，差异均有统计学意义（t= 12.847，P＜ 0.05，图3）。

图3 miR-150 靶向并调控HMGA2 的表达Fig.3 miR-150 targets and regulates the expression of HMGA2

2.6 miR-150 通过靶向HMGA2 对RB 细胞增殖和凋亡的影响与NC mimic 组比较，miR-150 mimic 组RB 细胞中HMGA2 mRNA 和蛋白水平显著降低，细胞增殖能力显著降低，细胞凋亡率显著升高；与miR-150 mimic+Vector 组比较，miR-150 mimic+pcDNA-HMGA2 组RB 细胞中HMGA2 mRNA和蛋白水平显著升高，细胞增殖能力显著升高，细胞凋亡率显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05，表3）。

表3 各组细胞中HMGA2 mRNA、蛋白水平、细胞增生值和细胞凋亡率的比较Tab.3 Comparison of HMGA2 mRNA， protein levels， cell proliferation value and cell apoptosis rate in each group ±s

表3 各组细胞中HMGA2 mRNA、蛋白水平、细胞增生值和细胞凋亡率的比较Tab.3 Comparison of HMGA2 mRNA， protein levels， cell proliferation value and cell apoptosis rate in each group ±s

注：与NC mimic组比较，aP ＜ 0.05；与miR-150 mimic+Vector组比较，bP ＜ 0.05

组别NC mimic组miR-150 mimic组miR-150 mimic+Vector组miR-150 mimic+pcDNA-HMGA2组F值P值凋亡率（%）8.12 ± 0.53 18.47 ± 1.24a 19.35 ± 1.36 11.56 ± 0.71b 55.724＜ 0.05例数3 3 3 3 HMGA2 mRNA 1.00 ± 0.09 0.37 ± 0.04a 0.39 ± 0.03 0.88 ± 0.08b 49.566＜ 0.05 HMGA2蛋白0.61 ± 0.08 0.28 ± 0.03a 0.29 ± 0.06 0.51 ± 0.05b 15.803＜ 0.05细胞增生值（A）0.71 ± 0.07 0.34 ± 0.03a 0.36 ± 0.05 0.59 ± 0.08b 17.392＜ 0.05

3 讨论

越来越多的研究发现，许多lncRNA 与各种生物学过程和疾病相关，包括癌症的进展。先前的证据也证明lncRNAs 的表达在多种癌症中存在失调，这些异常的lncRNAs 可能参与了癌症的进展［9-10］。研究［11-12发现，一些lncRNAs 作为致癌基因或抑癌基因在RB 的发生发展中发挥重要的调节作用］。例如，LncRNA ELFN1-AS1通过调控miR-4270/SBK1 轴促进RB 细胞生长和侵袭［13］。沉默LEF1-AS1 可通过调控Wnt/β-catenin 通路抑制RB细胞的增殖、迁移和侵袭［14］。然而，FAM83A-AS1在RB 中的作用鲜有报道。本研究深入研究了FAM83A-AS1 在RB 中的作用和机制。首先，本研究评估了FAM83A-AS1 在RB 细胞系SO-RB50、HXO-RB44和Y79细胞中的表达。结果发现人视网膜母细胞瘤细胞（SO-RB50、HXO-RB44 和Y79）中FAM83A-AS1 的表达均显著高于人正常视网膜上皮细胞，且FAM83A-AS1 在Y79 细胞中表达最高。该发现与以往研究结果［15-16］类似，即FAM83A-AS1在胰腺癌中均较正常组织明显上调，FAM83A-AS1的高表达与胰腺癌不良预后呈正相关，FAM83AAS1 可促进胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭。本研究选取Y79 细胞进行进一步功能实验，结果显示过表达FAM83A-AS1 可显著促进RB 细胞增殖能力，抑制RB 细胞凋亡，而敲低FAM83A-AS1 可显著抑制RB 细胞增殖能力，促进RB 细胞凋亡。以上研究结果表明FAM83A-AS1 敲低在RB 中具有抗肿瘤作用。因此，FAM83A-AS1 可能成为一种新的治疗RB 的生物标志物和潜在的治疗靶点。

大量证据［17-19］表明，lncRNAs 可通过调节miRNAs 的表达发挥促癌或抑癌作用。其中，FAM83AAS1 可能通过调控不同的miRNAs 在不同的肿瘤中发挥其抗肿瘤作用。例如，lncRNA FAM83AAS1 通过与miR-495-3p 靶向结合，加重食管癌的恶性发展［20］。LncRNA FAM83A-AS1通过靶向miR-141-3p 促进肺腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间充质转化进程［21-22］。本研究通过生物信息学和双荧光素酶报告基因实验表明，FAM83A-AS1 靶向并负调控miR-150 的表达。本研究通过挽救实验进一步表明，抑制miR-150 可逆转FAM83A-AS1 沉默对RB 细胞增殖和凋亡的作用。以上结果表明，沉默FAM83A-AS1 可靶向miR-150 并发挥其抗肿瘤作用，可能为RB 的治疗提供了新的思路。

有学者研究［23］显示，miRNAs 在视网膜的生理功能以及疾病发生过程中发挥着重要作用，提示我们可以通过调控眼组织miRNAs 的表达来治疗并控制眼部疾病的发生、发展。然而，关于miR-150在RB 中的功能研究较少。有许多研究［24］表明miR-150 可作为肿瘤抑制因子参与肿瘤的发生发展，例如，miR-150 通过靶向Gli1 抑制结直肠癌细胞侵袭和转移。此外，研究［25］发现miR-150-5p 通过靶向PYCR1 表达来抑制鼻咽癌的进展。本研究结果发现，过表达miR-150 显著抑制RB 细胞增殖，促进细胞凋亡。以上数据表明，miR-150 在RB的进展中发挥了抗肿瘤作用。为了进一步阐明miR-150 对RB 进展的作用机制，本研究通过生物信息学软件和双荧光素酶报告基因实验预测和验证HMGA2 是miR-150 的靶基因。HMGA2 是高迁移率组蛋白家族成员之一，是一种染色质重塑因子，与DNA 中at 富集区域结合。HMGA2 的上调被认为是RB 患者临床预后较差的生物标志物，并且HMGA2 表达上调与RB 患者的不良预后相关［26］。本研究证明了miR-150 过表达抑制了RB 细胞中HMGA2 mRNA 和蛋白的表达。更重要的是，HMGA2 过表达逆转了miR-150 对RB 细胞进展的作用，提示miR-150 可能通过调控HMGA2 在RB中发挥抗肿瘤作用。

综上所述，本研究结果发现FAM83A-AS1 在RB 细胞中上调。敲低FAM83A-AS1 可抑制RB 细胞增殖，诱导RB 细胞凋亡。FAM83A-AS1 作为RB的致癌基因，其机制可能是通过靶向miR-150/HMGA2 轴参与RB 细胞的进展，提示FAM83A-AS1是RB 细胞中一种新的致癌lncRNA，是RB 诊断、预后和治疗的一种有前景的生物标志物。

【Author contributions】ZHOU Xiaoping： collected data and drafted the article； PENG Zhengwu， CHEN Shuyang： statistical analysis and technical support； LIU Ru， TIAN Tao， OU Yulun： designed the experiment and drafted the article.All of the authors declare that there is no conflict of interest.All authors read and approved the final manuscript as submitted.