下调胰岛素样生长因子抑制miR-767-5p的表达对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间充质转化的影响

刘海英 陈峰 姚嘉

海南省人民医院1乳腺外科，2综合介入科（海口 570000）

乳腺癌是妇女最常见的癌症，全世界每8 名妇女中约有1 例有患乳腺癌的累积风险［1］。乳腺癌也是妇女癌症死亡的主要原因，占癌症病例的25%，占癌症相关死亡的15%［2］。多数乳腺癌病例在早期是可以治疗的，但约有20% ～ 30%患者的癌细胞会从原发部位扩散到其他部位，如骨骼、脑、远处结节、肝、肺和胸膜转移［3-6］。目前临床上对于乳腺癌的治疗方法主要包括化疗和放疗等非特异性的治疗方法，缺乏针对性的治疗方法。因此，需要找到新的治疗靶点用于乳腺癌的治疗。

miRNAs 是调节基因表达的关键分子，能够影响细胞的生物学功能，促进疾病的发生和发展。在癌症中，许多miRNAs 作为致癌基因或肿瘤抑制剂发挥作用，促进肿瘤的生长、入侵和血管生成［7］。胰岛素样生长因子-1（insulin like growth factor，IGF1）是一种调节乳腺发育的小多肽，在癌症的发展中具有多种生物学效应，能调节干细胞、基因组稳定性、细胞代谢和血管生成等［8］。在乳腺癌中，IGF1能诱导肿瘤细胞增殖和迁移，其高表达与乳腺癌的风险增加相关，因此IGF1 有望成为乳腺癌治疗的新靶点［9］。本实验室前期通过生物信息学方法筛选出差异表达的miRNA 即miR-767-5p 显著上调及预测靶基因为IGF1，并通过实验证明miR-767-5p 与IGF1靶向结合［10］。本研究以差异表达最明显的乳腺癌细胞（MCF-7）为研究对象，以miR-767-5p为切入点，观察抑制miR-767-5p的表达对乳腺癌增殖、侵袭和EMT的影响，探讨其对乳腺癌侵袭转移和 EMT的作用及分子机制，为寻找新的乳腺癌治疗靶点奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料MEM 培养基，胎牛血清均购自美国Gibco；MEM Non-Essential Amino Acids Solution（NEAA）购自美国invitrogen；Sodium Pyruvate 购自日本Sigma；完全培养基：MEM+10%FBS+1%Glutamax+1%NEAA+1%Sodium Pyruvate+终浓度为0.01 mg/mL 的insulin；PBS 和0.25%胰蛋白酶均购自美国TBD；重组人胰岛素溶液购自武汉普诺赛生命科技；结晶紫购自上海碧云天生物技术；甲醛购自上海麦克林生化科技；Lipofectamine2000 购自上海一基生物科技；matrigel 购自吉林吉春制药；Tween-20 和BCA 蛋白浓度测定试剂盒，RIPA（强）组织细胞快速裂解液，十二烷基硫酸钠（SDS ），TEMED ，过硫酸铵购自北京索莱宝科技；蛋白质Marker 购自Biohelix；E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9、IGF1、GAPDH 一抗和Goat anti-Rabbit IgG 二抗购自武汉贝茵莱生物科技；MCF-7 购自中国科学院上海细胞库。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养MCF-7 细胞转接至完全培养基中在37 ℃、5% CO2的条件下培养。在80% ～ 90%的细胞密度下，0.25%的胰蛋白酶进行细胞传代。

1.2.2 细胞转染及转染效率验证根据miR-767-5p 序列（UGCACCAUGGUUGUCUGAGCAUG），分别合成miR-767-5p inhibitor、inhibitor-NC，使用Lipofectamine™3000 转染试剂进行转染。正常细胞作为空白对照组，转染miR-767-5p inhibitor 作为实验组，转染inhibitor-NC 作为阴性对照组，采用荧光染色检测转染效率。

1.2.3 CCK-8 实验检测细胞的增殖能力将细胞按照5 000 个细胞/孔接种于96 孔板中，分别培养24、36、48、60 和72 h 后向孔中加入10 μL CCK-8试剂，并于37 ℃下培养6 h。使用微板读数器测定450 nm 波长下的光密度。

1.2.4 Transwell 实验检测细胞侵袭能力在试验开始前24 h，用无血清培养液替换培养各组别的细胞。在接种之前，用 PBS 将24 孔板及 Transwell小室浸泡5 min。将80 μL matrigel 凝胶涂于小室内，37 ℃ 培养30 min。消化细胞接种到Transwell小室内，下层的24 孔板中加入0.75 mL 含10% FBS 的培养液，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养48 h。PBS清洗后加入1 mL 4%甲醛溶液，室温固定20 min。吸去固定液，PBS 洗涤后加入1 mL 0.5%结晶紫溶液，染色30 min 后，使用棉签将 Transwell 小室没有迁移的细胞擦去后将其放置于200 ×显微镜下，对其进行观察，并对每个视野中的细胞数进行统计。

1.2.5 划痕实验检测细胞迁移能力先用marker笔在6 孔板背后，竖着均匀画线。在每孔中加入1 × 106个细胞，次日用枪头在背后的直线垂直划痕。用PBS 冲洗去除划下的细胞，按照不同分组处理细胞，加入无血清培养液在37 ℃和5% CO2条件下继续培养。在0、48 h 分别拍照，在0、48 h 分别拍照，在拍照的时候，将画线和划痕的交点作为观察点，定点观察。

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验检测miR-767-5p和IGF1 的结合将野生型（WT）或突变型（MUT）IGF1 的3′UTR 扩增并克隆到pmirGLO 载体中。然后，将HEK293T 细胞接种在96 孔板上，并与WT 或MUT 萤光素酶质粒和miR-767-5p 或对照miRNA共转染。使用双荧光素酶报告物测定系统来测量荧光素酶活性。

1.2.7 IGF1 相对表达量检测用 Trizol 法提取总RNA，Takara 逆转录试剂盒逆转录获得cDNA 并进行qPCR 检测IGF1 相对表达量，以GAPDH 为内参，用2-△△Ct法计算基因相对表达量。其引物序列如下：IGF1（F：5′-TGTCCTCCTCGCATCTCTTCT-3′；R：5′-CCATACCCTGTGGGCTTGT-3′）；GAPDH（F：5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′；R：5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′）。

1.2.8 Western blot 检测取出培养箱中的细胞，将培养液吸去后，对预冷的PBS 进行两次洗涤，然后按照每1 × 106个细胞加入200 μL 裂解液的比例加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液。BCA试剂盒检测蛋白浓度后每孔上样20 μg 蛋白。制备SDS-PAGE 凝胶并电泳，使用PVDF 膜湿转转膜。5%脱脂奶粉室温封闭4 ℃过夜。一抗E-cadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、MMP-2（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）、IGF1（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）和膜室温孵育1 h。用PBST 清洗3 次，每次5 min。随后1∶10 000 稀释二抗（含HRP 标记），再次孵育清洗。全自动化学发光分析仪检测，并通过TANON GIS 软件读取条带灰度值。

1.3 统计学方法数据资料以SPSS 19.0软件为主要工具进行方差分析，实验数据以均数±s表示。两组间样本采用单因素方差分析及t检验。P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光检测转染效率Lipofectamine™3000 转染试转染乳腺癌细胞后，可根据细胞内有无绿色荧光判断转染是否成功。荧光显微镜观察发现，miR-767-5p inhibitor 和inhibitor-NC 转染组细胞内均可见绿色荧光，Control 组无荧光信号，表明miR-767-5p inhibitor 和inhibitor-NC 均能成功转染乳腺癌细胞。见图1。

图1 荧光显微镜观察转染效率（100 ×）Fig. 1 Transfection efficiency with a fluorescence microscope（100 ×）

2.2 抑制miR-767-5p的表达对细胞增殖的影响CCK-8实验结果显示，与Control组和inhibitor-NC组相比，miR-767-5p inhibitor 组显著抑制MCF-7 细胞的增殖（P＜ 0.05），见图2。

图2 抑制miR-767-5p 的表达对细胞增殖的影响Fig. 2 Effect of suppression of miR-767-5p expression on the cellular proliferation of MCF-7 cells

2.3 抑制miR-767-5p的表达对细胞侵袭的影响由侵袭实验结果可知，Control 组侵袭细胞数为（245.33 ± 5.69）个，miR-767-5p inhibitor组、inhibitor-NC 组侵袭细胞数分别为（128.67 ± 6.35）、（248.67 ±8.33）个。与Control 组和inhibitor-NC 组比较，miR-767-5p inhibitor 组对MCF-7 细胞侵袭数明显减少（P＜ 0.05），见图3。

图3 抑制miR-767-5p 的表达对细胞侵袭的影响Fig. 3 Effect of suppression of miR-767-5p expression on the cellular invasion of MCF-7 cells

2.4 抑制miR-767-5p的表达对细胞迁移的影响划痕试验显示，划痕48 h 后，miR-767-5p inhibitor组对MCF-7 细胞的迁移较Control 组和inhibitor-NC组存在明显的抑制作用，见图4。

图4 抑制miR-767-5p 的表达对细胞迁移的影响Fig. 4 Effect of suppression of miR-767-5p expression on the cell migration of MCF-7 cells

2.5 抑制miR-767-5p 的表达对迁移相关蛋白MMP-2 和MMP-9 的蛋白表达的影响与Control组和inhibitor-NC 组比较，miR-767-5p inhibitor 转染组的MMP-2 和MMP-9 蛋白表达水平显著降低（P＜ 0.05），Control 组和inhibitor-NC 组的MMP-2 和MMP-9 蛋白表达差异无统计学意义（P＞ 0.05），进一步表明miR-767-5p inhibitor 可以抑制MMP-2 和MMP-9 的表达。见图5。

图5 MMP-2 和MMP-9 的蛋白表达水平Fig. 5 The protein expression levels of MMP-2 and MMP-9

2.6 miR-767-5p 和IGF1 的靶向结合关系TargetScan 数据库预测miR-767-5p 和IGF1 具有结合位点（图6A）。RT-qPCR 检测敲除miR-767-5p 后，IGF1 的表达水平，结果显示，敲除miR-767-5p 后，IGF1 的表达水平显著升高（图6B）。荧光素酶报告基因实验结果显示，与pLUC-IGF1-mut 共转染时，突变体3′-UTR 载体的活性不受miR-767-5p mimics 同时转染的影响（图6C）。

图6 乳腺癌中miR-767-5p 和IGF1 的靶向结合Fig.6 Targeted binding of miR-767-5p and IGF1 in breast cancer

2.7 抑制miR-767-5p 的表达对IGF1 表达的影响与Control 组和inhibitor-NC 组比较，miR-767-5p inhibitor 转染组IGF1 的蛋白和mRNA 表达水平显著降低（P＜ 0.05），Control 组和inhibitor-NC 组的MMP-2 和MMP-9 蛋白表达差异无统计学意义（P＞ 0.05），这表明miR-767-5p inhibitor 可以抑制IGF1 的表达。见图7。

2.8 抑制miR-767-5p 的表达对EMT 相关蛋白Ecadherin 和N-cadherin 表达的影响与Control 组和inhibitor-NC 组比较，miR-767-5p inhibitor 组显著提高E-cadherin 蛋白表达（P＜ 0.05），显著降低N-cadherin蛋白表达（P＜ 0.05），Control组和inhibitor-NC 组的E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表达差异无统计学意义（P＞ 0.05），这进一步表明miR-767-5p inhibitor 可以影响E-cadherin 和N-cadherin 的表达。见图8。

图8 E-cadherin 和N-cadherin 的蛋白表达水平Fig. 8 The protein expression levels of E-cadherin and N-cadherin

3 讨论

癌症在全球所有疾病中病死率居第2 位，仅次于心脑血管疾病，90%的癌症死亡是由于肿瘤转移引起的［11］。其中乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，是导致妇女疾病死亡的主要原因［12］。乳腺癌容易发生转移，细胞自身可以通过血管生成获得营养和氧气，然后转移到其他新组织形成继发性肿瘤，增加乳腺癌治疗的难度。转移性乳腺癌5 年的生存率为25% ～ 30%，预后较差［13］。因此需要迫切找到治疗乳腺癌的靶点，miRNA 能调节基因表达，许多miRNAs 作为致癌或抑癌基因发挥作用，本课题组确定miR-767-5p 在乳腺癌中异常表达，先前研究发现，miR-767-5p 通过靶向SUZ12 抑制神经胶质瘤增殖和转移［14］；LINC-PINT通过下调miR-767-5p 诱导TET2 表达抑制甲状腺癌症侵袭性［15］；Circ-SMARCA5 靶向miR-767-5p 抑制多发性骨髓瘤的进展［16］；CircNOL10 通过吸收miR-767-5p 调节SOCS2/JAK/STAT 信号抑制乳腺癌症进展［17］，以上研究提示miR-767-5p 在多种癌症中均发挥作用。癌细胞迁移和侵袭是肿瘤转移的重要组成成分，是肿瘤癌症患者死亡的主要原因［18-19］。抑制癌细胞的迁移和侵袭可以延缓肿瘤的恶化［20］。在本实验中，Transwell 和侵袭实验结果表明转染miR-767-5p 抑制剂后，乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力被抑制。这表明抑制miR-767-5p的表达通过抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭抑制肿瘤转移。

肿瘤细胞通过血管生成积累营养物质，促进EMT，促进肿瘤生长。肿瘤周围血管壁较弱，使其易进入血液和转移。研究表明，与良性肿瘤相比，恶性肿瘤周围新血管数量明显增加［21］。EMT 是上皮细胞向间充质细胞转化的过程，能有效地促进肿瘤细胞的生长、耐药和增殖。EMT 改变了肿瘤细胞的类型，提高了肿瘤细胞降解基质的能力，削弱了肿瘤胞间结合力，肿瘤细胞转移和侵袭能力增强，存活率升高。EMT 能够使肿瘤细胞脱离原发灶或转移灶，形成新的继发转移灶［22-23］。无数实验证明EMT 使上皮细胞标志蛋白E-cadherin 表达下降，间质细胞标志蛋白N-cadherin 表达增加［24-26］。本研究中，转染miR-767-5p 抑制剂后乳腺癌细胞中E-cadherin 蛋白的表达上调，N-cadherin 蛋白的表达下调。此外，转染miR-767-5p抑制剂后MMP-2和MMP-9 蛋白表达水平以及IGF1 的蛋白和mRNA表达水平均下调。这一结果表明，抑制miR-767-5p 的表达可能通过抑制IGF1 抑制乳腺癌细胞发生EMT，并由此抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移。

综上所述，抑制miR-767-5p 的表达能抑制IGF1 的表达，阻断乳腺癌细胞EMT 过程并抑制其侵袭和迁移。miR-767-5p 可能成为乳腺癌治疗的潜在靶标，有望用于乳腺癌转移治疗临床应用。

【Author contributions】LIU Haiying performed the experiments and wrote the article. CHEN Feng performed the experiments. LIU Haiying and YAO Jia revised the article. LIU Haiying designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.