肺动脉高压实验模型的研究进展

谢锦程肖梦媛邓少东*陈建英*

(1.广东医科大学附属医院,广东 湛江 524001;2.广东医科大学附属东莞第一医院,广东 东莞 523710;3.广东医科大学第二临床医学院科研平台,广东 东莞 523808)

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一种严重的临床疾病,其组织病理特征是持续性的血管收缩、血管重构、血管周围炎症反应和纤维素样坏死,继而引发血管管腔狭窄和闭塞,导致肺血管阻力进行性增高,最终引起右心衰竭。流行病学显示,特发性和遗传性肺动脉高压发病率为每百万居民5 例,患病率为每百万居民25 例,并且呈现上升的趋势[1]。肺动脉高压患者的1 年、3年、5 年和7 年的生存率分别为85%、68%、57%和49%,中位生存期约为7 年[2]。尽管近年来国内外学者对肺动脉高压的发病机制研究取得了重要进展,但肺动脉高压仍然无法治愈,患者的2 年和3 年的死亡率仍高达21%[3-5],这主要与其发病机制的复杂性有关。同时受临床标本的来源及伦理学的影响,围绕肺动脉高压发生发展机制的临床研究极具挑战性。而建立动物模型以及细胞模型可以全面了解肺动脉高压的病因和病理过程,便于进行新型药物和干预手段的筛选和研究。因此,选择合适的实验模型是探索肺动脉高压发病机制及其药物治疗研究的基础。本文旨在总结近年来肺动脉高压实验模型的建模方法,比较各种模型的优缺点,为肺动脉高压发病机制的探索和临床研究提供参考。

1 动物模型

1.1 野百合碱诱导肺血管内皮细胞损伤模型

野百合碱(monocrotaline,MCT)是一种具有致突变和致癌功效的吡铬里西啶生物碱,可从豆类植物和野猪粪便中提取获得。研究表明,野百合碱在体内被肝代谢产生具有肺毒性的野百合碱吡咯(MCTP),进而损伤血管内皮细胞,导致肺动脉高压[6]。在构建野百合碱模型时,最常选择的实验动物为大鼠,通过单次腹腔或者皮下注射MCT(通常剂量为60~80 mg/kg)来诱发肺动脉高压[7-8]。由于腹腔内腹膜面积大、吸收快,使用腹腔注射野百合碱可能会使大鼠死亡率升高,因此建模时多采用皮下注射野百合碱。在注射野百合碱后的5~6 周内,约有一半大鼠会死亡,为了提高模型大鼠的成活率,Zhuang 等[9]对经典野百合碱模型进行了改进,采用腹腔注射两次MCT(剂量为20 mg/kg)的建模方案,两次注射之间间隔7 d,该建模方案可减轻模型大鼠心脏组织的受损,降低其血管周围的炎症反应水平以及心肌细胞纤维化的程度,从而显著提高模型大鼠的存活率[10]。与大鼠相比,单次注射野百合碱并不能在小鼠体内引发肺动脉高压。即使直接注射足够剂量的MCTP 也难以重现野百合碱在大鼠体内诱导的肺血管肌化以及右心室收缩压明显升高的症状,这可能与小鼠代谢野百合碱的方式有关[11]。而建立小鼠肺动脉高压模型的方法,常采用每周皮下注射MCT(剂量为600 mg/kg),持续4~8 周[12]。该模型建模周期长且耗费多,因此大鼠是建立野百合碱诱导模型的首选实验动物。

大鼠注射野百合碱后,通常不会立即出现肺动脉高压的临床症状,而是在3~4 周后出现呼吸困难、哮鸣音、口鼻腔出血等症状。解剖观察显示,大鼠的右心室明显肥大和扩张,右心室游离壁显著增厚[13-16]。野百合碱引起的病理性改变包括内皮功能障碍和平滑肌细胞的增殖,进而导致血管重构、血管周围炎症以及心肌纤维化[17-19]。研究显示,野百合碱会损害肺动脉内皮细胞,引起内皮功能障碍,继而增加血管收缩剂包括内皮缩血管肽1、血管紧张素Ⅱ、血栓素A2 的表达水平。同时NO 和前列环素等血管扩张素的合成减少,随后TGF-smad 和BMPR-2 信号通路被激活,导致血管收缩和血管重塑增加[7,20-22]。关于野百合碱模型的研究显示,炎症细胞(巨噬细胞、树突细胞、淋巴细胞和肥大细胞)和细胞因子在肺血管重塑早期阶段起关键作用[23-24]。在大鼠注射野百合碱的第1 周,仅有肿瘤坏死因子-α、白介素-1β 升高,表明此时处于急性炎症期。随后,在慢性炎症期,促炎因子如肿瘤坏死性因子-α、白介素-1β、白介素-6、白介素-12 和抗炎因子精氨酸酶1、白介素-10、肿瘤坏死因子-β水平升高。随着肺动脉高压的发展,PI3K/Akt 信号通路表达上调,并与促炎蛋白相关。此外,NF-κB 信号通路也被激活,这也在一定程度上揭示了野百合碱诱导肺动脉高压的炎症特征[25]。

野百合碱模型具有价格低廉、技术要求低的特点,可帮助我们全面了解肺血管重塑的过程以及其病理生理的机制。根据最近研究显示,中药化合物(木犀草素、柚皮苷、黄芩素)、磷酸二酯酶5 抑制剂(西地那非)、Rho 激酶抑剂(Y-27632、法舒地尔)、钠葡萄糖协同转运蛋白2 抑制剂(达格列净)、内皮素受体拮抗剂(波生坦、哌拉西坦)、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(氟西汀)、靶向小分子抑制剂(Seralutinib),均能改善野百合碱诱导的肺动脉高压症状[26-34]。同时,野百合碱还具有广泛毒性,常引起肝损伤、肾功能不全、肺部纤维化等症状[35-37]。综上所述,野百合碱模型常用作肺动脉高压药物筛选研究的首选动物模型。

1.2 经典缺氧模型

采用慢性缺氧诱导肺动脉高压动物模型,常用的实验动物为大鼠和小鼠。造模时,将动物置于10% O2低氧舱中,持续3~4 周,即可建立缺氧性肺动脉高压模型[38-39]。研究显示,将Sprague-Dawley大鼠和C57BL/6 小鼠同时暴露于低压缺氧中1~3周后,两种动物都表现出肺动脉高压的相关症状,但C57BL/6 小鼠的肺血管重塑程度和肺动脉的压力均低于Sprague-Dawley 大鼠[40]。另外,将3 月龄的雄性大鼠和12~14 月龄的雄性大鼠暴露于慢性缺氧环境(置于海拔5486 m),持续时间为1~42 d。结果显示,在缺氧期间,3 月龄大鼠表现出血管肌化的特征,而12~14 月龄大鼠的血管形态几乎未发生变化[41]。提示慢性缺氧引起肺血管结构改变的过程与物种或动物的发育阶段显著相关[42]。

慢性缺氧引起的结构改变包括肺泡壁非肌化血管中平滑肌样细胞和成纤维细胞的聚集和分化、单核细胞/祖细胞的募集以及内皮-间充质转化[42-44]。此外,肺动脉平滑肌细胞在缺氧条件下会显著肥大,并参与内膜增厚的发展[45]。动物在急性和慢性的缺氧环境中会增加肺部的炎症细胞因子、趋化因子和粘附分子的表达,并导致白细胞在肺和肺血管内及周围集聚。白介素-1、白介素-6 和肿瘤坏死因子-α 等炎性因子的上调介导肺动脉平滑肌细胞的增殖,促进肺动脉高压中血管重塑[46-49]。一旦动物离开缺氧环境并恢复至常压氧条件,上述变化中的大部分可以逆转。因此,缺氧模型仅适用于研究非严重程度的肺动脉高压类型。为了进一步改进模型,Coste 等[50]将慢性缺氧与野百合碱相结合,即将大鼠腹腔注射MCT(剂量为60 mg/kg)后置于380 mmHg 的低压舱中3 周。研究结果显示,大鼠出现了严重动脉病变,包括血管的炎症、血管重塑和血栓性、严重的内膜病变和早期的丛状病变,这些组织学特征与肺动脉高压患者肺部的组织学特征相似。

1.3 Sugen 5416/缺氧模型

Sugen 5416 是一种3-吲哚-2-酮化合物,其主要作用是拮抗血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶1/2(VEGFR1、VEGFR2)、抑制血管生成,可使实验动物产生肺动脉高压。通过给大鼠单次皮下注射Sugen 5416(剂量为20 mg/kg),随后置于常压常氧条件下饲养5 周,即可观察到肺动脉高压症状[51]。当将Sugen 5416 与慢性缺氧暴露联合应用,即单次注射Sugen 5416 后继续进行慢性缺氧暴露3 周,可诱导出现更为严重的肺动脉高压症状[52]。小鼠需要持续暴露于10% O2的环境下,并每周腹腔注射1次Sugen 5416(剂量为20 mg/kg),给药持续3 周,才可建立Sugen 5416/缺氧模型[53]。Sugen 5416/缺氧诱导的肺动脉高压主要的组织学特征为肺动脉内皮细胞和肺血管平滑肌细胞的过度肥大/增殖。Sugen 5416 可直接抑制血管内皮生长因子介导的内皮细胞增殖,从而形成闭塞性丛状病变[54]。与单纯慢性缺氧模型不同,Sugen 5416/缺氧模型的病变是不可逆转的[55]。

在Sugen 5416/缺氧模型的基础上,进一步改进得到了Sugen 5416/缺氧/常氧模型。该模型动物在单次注射Sugen 5416 后经过低压缺氧3 周,然后恢复到常压氧环境下饲养10 周[56-57]。Sugen 5416/缺氧/常氧模型组动物的右心室游离壁/左心室+隔膜重量比在第1 周即显著升高,小动脉开始出现不同程度的阻塞,随后经过10 周的复氧,形成了严重复杂闭塞性丛状病变形成[56]。该模型诱导的肺动脉高压与人类肺动脉高压的特征十分相似。

Sugen 5416 具有特异性结合内皮细胞的能力,并通过在持续抑制血管内皮生长因子受体发挥作用。Sugen 5416 可抑制VEGFR、TGF-β1/Smad2/Smad3、MAPK、BMPR2、HIF-1α、Rho 激酶,同时激活右心室巨噬细胞募集以及炎症反应调节因子NF-κB的表达。这导致内皮细胞和平滑肌细胞的无序增殖,并引起肺内血管周围炎症细胞的聚集,这些因素共同促成严重的血管阻塞性和丛状病变的发生[58-63]。然而,这些症状与物种和性别存在密切关联。研究显示,雌性大鼠的雌激素和孕激素能够减少Sugen 5416 引起的内皮细胞凋亡,从而降低发生肺动脉高压的风险[64]。另外,在建立Sugen 5416/缺氧/常氧小鼠模型时采用了类似Sugen 5416/缺氧/常氧大鼠肺动脉高压模型的方案。小鼠在模型中表现出肺动脉压升高和肺小动脉内侧壁增厚等肺动脉高压的症状,但没有明显的肺血管闭塞性病变,也缺乏与大鼠模型和晚期肺动脉高压患者相似的右心室衰竭和血管重塑[65]。相比之下,Sugen 5416/缺氧/常氧大鼠模型更具有与人类肺动脉高压相似的严重肺动脉高压症状。因此该模型被广泛应用于研究肺动脉高压,并被认为是最常用的啮齿动物模型之一。

近年来,与Sugen 5416 相关的双击模型不断出现。其中,无胸腺(T 细胞缺陷)的大鼠只需单剂量Sugen 5416 即可诱发严重的肺动脉高压,并且其炎症程度更为严重[66]。另一种模型是使用Sugen 5416 联合左肺切除术,在大鼠体内诱导血管闭塞性肺动脉高压。该模型表现出的症状与细胞增殖和促凋亡信号通路的激活相关[67-68]。此外,单次皮下注射Sugen 5416(剂量为20 mg/kg)联合腹腔持续注射吗啡(剂量为10 mg/kg)35 d,也能诱发大鼠出现肺动脉高压。吗啡的使用会加重Sugen 5416 引起的肺动脉高压症状,包括近端血管平滑肌的肥大、内膜病变以及右心室肥大[69]。

1.4 血吸虫模型

与肺动脉高压相关的寄生虫病中,最常见为血吸虫病。血吸虫病可由曼氏血吸虫和日本血吸虫引起,并可导致血吸虫性肺动脉高压(chistosomiasisinduced pulmonary arterial hypertension,SchPAH)[70]。相对于雄性小鼠,雌性小鼠对血吸虫的感染更为敏感,因此常使用雌性C57/BL6 成年小鼠作为模型动物。建立SchPAH 模型的方法是使用含有曼氏血吸虫75~100 个尾蚴(用于亚急性研究)或30 个尾蚴(用于慢性研究)的混悬液经皮感染。在亚急性研究中,小鼠的肺部几乎没有虫卵以及肺血管重塑的出现。但在慢性感染的研究中,建模12周后小鼠出现明显的肺血管重塑,并伴有血管周围炎症以及丛状病变。然而,亚急性感染和慢性感染研究中,右心室收缩压或右心室游离壁/左心室+隔膜比率并未升高[71]。

Graham 等[72]对血吸虫模型进行了改进,首先,将小鼠的尾巴放入含有30~35 个尾蚴的烧瓶中,经皮感染持续30 min。55 d 后,将悬浮在0.5 mL 无菌盐水的5000 个活卵通过尾静脉注射进入小鼠体内,以此对小鼠进行静脉内攻击。虫卵的静脉攻击模拟慢性感染中小鼠形成侧支分流,并使虫卵通过侧支分流沉积在肺部这一过程。Kumar 等[73]在此基础上对模型进一步改进,首先使用血吸虫卵(每克体重240 个虫卵)进行腹膜内致敏,以引发小鼠的免疫细胞应答。随后,经过两周的时间,经小鼠尾静脉注射血吸虫卵(每克体重175 个虫卵)进行静脉内攻击,致使卵团栓塞至肺部,从而驱动Ⅱ型免疫反应。这种新方法制备的血吸虫模型能够模拟人类血吸虫性肺动脉高压的关键病理特征,包括Th2 炎症、血管重塑和右心室收缩压升高。此外,这种建模方法实验周期较短和死亡率较低[74]。

除了曼氏血吸虫外,日本血吸虫也被证实可引起实验性肺动脉高压。Kassa 等[75]使用与Kumar等[73]相同的方案建立日本血吸虫诱导模型。研究结果显示,日本血吸虫感染引起了小鼠的血管重塑和血管炎症。然而,与曼氏血吸虫模型相比,日本血吸虫感染引起的症状较为轻微。

1.5 肺切除术联合野百合碱或者Sugen 5416 模型

大鼠实施左肺切除手术1 周后,通过单次皮下注射MCT 60 mg/kg 或Sugen 5416 25 mg/kg,可在4周内引发严重肺动脉高压和进行性右心衰竭[67,76]。该模型成功模拟了肺血流量增加导致的肺血管重塑,在模型组大鼠中观察到丛状血管损伤、内膜增厚、远端小动脉血管栓塞、血管炎症以及肺动脉和右心室压力显著增高等症状[77]。将左肺切除术与野百合碱或Sugen 5416 相结合可建立比单独使用野百合碱、缺氧或其他方法更为可靠的严重肺动脉高压模型。然而,该模型要求技术人员熟知大鼠的解剖结构,并具备熟练的外科技能。术中需要严格遵守无菌操作,而术后恢复同样是模型制备成功的关键步骤。由于该模型需要特殊的手术技巧以及严格的环境要求,其使用受到一定限制。

1.6 其他动物

由于价格低廉和技术简单,并且易于进行大规模的独立实验,使得啮齿类动物成为许多实验研究中应用最多的肺动脉高压模型。除此之外,还有其他的动物用于制备肺动脉高压模型,Zeng 等[78]使用西藏小型猪单次腹腔注射MCT(剂量为12 mg/kg)成功制备肺动脉高压模型。Cao 等[79]通过在家兔胸部做正中切口行开胸术,将左颈动脉与肺动脉主干吻合以产生慢性左向右分流,3 个月后成功建立了高流量肺动脉高压模型。然而,上述这些动物模型应用并不常见,可能与动物的来源以及模型的制备难度有关。

上述肺动脉高压动物模型均有各自的特点,现归纳各模型的制备过程以及涉及到的病理特征等如下(见表1、表2)。

表1 肺动脉高压动物实验模型涉及的病理过程以及信号分子通路Table 1 Pathological process and signaling molecular pathways of PAH animal model

表2 肺动脉高压动物模型制备Table 2 Preparation of PAH animal models

2 细胞模型

建立合适且可靠的肺动脉高压体外模型对于研究疾病的病理机制以及探索分子机制具有重要意义,同时也有助于使用简单且可重复的技术来发现以及测试新的治疗方法。体外细胞模型具有易于获得、可重复利用、可再现心脏和血管的细胞和细胞外生态环境的特点,并能显示出细胞正常的生理特征。目前,用于构建肺动脉高压体外模型的细胞主要包括肺动脉内皮细胞和肺动脉平滑肌细胞。

2.1 物理损伤

肺动脉高压的标志性特征包括内皮功能障碍、内皮-间充质转化以及肺动脉平滑肌细胞的异常增殖、凋亡和迁移。通过将肺动脉内皮细胞或者肺动脉平滑肌细胞置于低氧室(通常是2%~10% O2)培养24 h,可诱导内皮细胞功能障碍以及平滑肌细胞的过度增殖、凋亡和迁移。Hua 等[80]将肺动脉平滑肌细胞和肺动脉内皮细胞置于10% O2低氧箱培养24 h,发现内皮细胞凋亡增加,NO 水平降低,细胞失去了其典型的鹅卵石形态和特征基因,从而确认内皮损伤模型建模成功[81-82]。Wang 等[83]将肺动脉平滑肌细胞置于低氧箱(5% O2、90% N2)中培养48 h,观察发现平滑肌细胞增殖增加以及凋亡抑制,可判断细胞模型建造成功。而Hu 等[84]研究显示,缺氧损伤会激活AKT/mTORC1 通路,从而诱导肺动脉平滑肌细胞的过度增殖和迁移。

物理缺氧损伤细胞模型因其操作简便、损伤效果明显且可避免造模剂带来的额外影响等优点,目前被广泛应用于制备研究内皮细胞和平滑肌细胞功能损伤相关模型。缺氧损伤诱导的细胞损伤机制与人类肺动脉高压所表现的病理损伤相似。

2.2 化学损伤

野百合碱吡咯是野百合碱的活性代谢物,Liu等[85]使用MCTP(剂量为50 μg/mL)与肺动脉内皮细胞共培养12~48 h,模拟野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠的肺动脉内皮细胞损伤。研究显示,MCTP 可降低NO 的水平、减少内皮细胞的迁移以及增加细胞凋亡[7]。引发内皮细胞损伤的因子还包括转化生长因子-β1、白介素-1β 以及肿瘤坏死因子-α 等,这些因子可刺激内皮细胞发生内皮-间充质转化,而内皮-间充质转化是炎症应激与内皮功能障碍之间复杂相互作用的关键环节[86-87]。

血小板衍生生长因子(PDGF)能够促进肺动脉平滑肌细胞和成纤维细胞增殖和迁移。因此,Wu等[1]在研究胰高血糖素样肽-1 受体激动剂线粒预防肺动脉高压的分子机制过程中,使用PDGF-BB(20 ng/mL)与肺动脉平滑肌细胞共培养24 h,模拟肺动脉高压中肺动脉平滑肌细胞发展进程,并利用该模型揭示肺动脉高压患者的潜在治疗靶点。

常见用于构建体外模型的其他因子包括肿瘤坏死因子-α 以及转化生长因子-β1。Cheng 等[88]对Claudin-1 是否参与了肺动脉高压的发生发展进行了研究。他们通过将肺动脉平滑肌细胞与肿瘤坏死因子-α(剂量为10 ng/mL)共同培养24 h,模拟肺动脉高压中炎性因子引起平滑肌细胞过度增殖和迁移增强的病理过程,并揭示了这些过程可能与ERK1/2 和NF-κB 信号通路相关。而Feng 等[89]则使用转化生长因子-β1 与肺动脉平滑肌细胞共培养24 h,诱导平滑肌细胞迁移增加,并揭示该病理过程与PI3K/Akt 和ERK 信号通路的相关性。

综上所述,目前常用于制备内皮细胞以及平滑肌细胞损伤模型的损伤因素均被证实与肺动脉高压的发生、发展有密切的联系,可较好地模拟与肺动脉高压相关的病理过程。这些模型在细胞损伤机制方面具有相似性,例如抑制肺血管内皮细胞中一氧化氮的生成,诱导肺动脉内皮细胞和肺动脉平滑肌细胞的炎症损伤等,但又具有不同的特点和优势。因此根据实验需求可以选择适宜的细胞模型,以获得期望中的结果。细胞模型易于培养、产量可观,并且实验结果具有可重复性,可为进一步的研究奠定基础。然而,要注意上述的模型仅仅是以血管内皮细胞或血管平滑肌细胞为研究对象,不能全面地反映肺动脉高压的病变过程,因此,体外细胞模型的研究结果仍需得到动物实验研究的支持。

现将各个细胞模型的具体制备方式以及模型涉及的病理机制归纳总结如下(见表3)。

表3 肺动脉高压细胞模型的制备以及模型涉及的病理机制Table 3 Preparation of PAH cell models and related pathological mechanisms

3 总结

为了深入研究肺动脉高压的发病机制,探索有效的治疗方法,研究人员开发了多种动物模型和细胞模型,并不断地进行改进。其中,缺氧诱导的肺动脉高压模型和野百合碱诱导的肺动脉高压模型被广泛应用。但这些模型仅展现了疾病的早期阶段,导致使用这些模型进行相关药物筛选研究时,仅针对改善血管的收缩过程,而忽略了肺动脉高压产生的血管进行性重塑。为了克服这一局限性,肺切除模型、Sugen 5416/缺氧等复合模型被相继建立,这些复合模型展现出了肺动脉高压的中期阶段,即血管丛状病变的症状。与动物模型相比,细胞模型在研究分子机制方面具有明显的优势,有利于预测和验证基因功能,并能微观地展现细胞间的代谢情况,同时节省构建模型的时间。细胞模型的不足之处在于缺乏全面性。而动物模型能够直观地展示肺动脉高压的病理过程,并更贴近人类肺动脉高压的病理特征。

如今随着分子生物学、基因技术的发展,越来越多与肺动脉高压病症相符合的实验模型被构建,并且随着实验动物学的不断进步,未来将会出现更加贴近于临床以及更具稳定性、经济性的实验模型,从而推动人类对肺动脉高压的研究。