腺苷三磷酸处理对鲜切黄瓜的保鲜作用

陈逸婷，汤 静，孟宪伟，王春飞，金 鹏，郑永华

（南京农业大学食品科学技术学院，江苏 南京 210095）

鲜切果蔬是最小限度加工的果蔬产品，具有食用方便、新鲜卫生等优点，广受消费者喜爱[1]。黄瓜（Cucumis sativusL.）果实肉质脆嫩、营养价值高，具清热解毒、减肥健体和美容护肤等功效，其鲜切产品是可生食大宗蔬菜品类的代表，在西式快餐、中式配餐等方面的市场需求量越来越大，发展前景广阔[2]。但切分等加工处理会造成机械损伤，使鲜切黄瓜在贮藏期间出现颜色变暗、果实软化和微生物滋生等现象，导致品质劣变、货架期变短[3]。能量亏损是引起果蔬采后品质劣变的关键因素，腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）是其生命活动的主要能量来源，外源ATP处理也因其安全有效而被用于果蔬保鲜。研究表明，采用外源ATP处理可保持南果梨[4]、龙眼[5]、荔枝[6]和绿豆芽[7]等果蔬较高的能荷水平，延缓其采后衰老和品质劣变进程，从而起到保鲜作用，但外源ATP处理对鲜切黄瓜保鲜的影响还鲜见研究报道。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）作为一种非蛋白氨基酸，在微生物和动植物中普遍存在，具有缓解焦虑、降低血压、治疗癫痫、提高记忆力和抗癌、抗衰老等生理功效[8]。植物性食品中GABA含量随种类和组织不同而存在差异，但总体含量较低，不能满足人体生理需求[9]。研究表明，植物在遭受盐害[10]、机械损伤[11]、缺氧[12]和低温胁迫[13]等逆境胁迫时，GABA含量会快速大量增加，以抵御逆境伤害。已有研究报道，鲜切加工导致的机械损伤可诱导鲜切梨[14]、胡萝卜[15]、猕猴桃[16]和莴苣[17]中GABA的积累。同时，切分处理造成的机械损伤也会促进鲜切果蔬中酚酸和黄酮类等酚类物质产生，从而发挥愈伤作用，抵御切分损伤[18]。如研究表明，鲜切加工能够促进鲜切紫甘蓝[19]、花椰菜[20]和火龙果[21]等鲜切果蔬中酚类物质含量增加，同时增强产品的抗氧化活性，且酚类物质的合成积累随着切分损伤强度的增加而增多，抗氧化活性也提高。因此，鲜切加工可望成为一种逆境胁迫方式来促进鲜切果蔬中酚类物质和GABA等活性成分含量提高，进而提高产品的抗氧化活性和潜在的营养保健价值。但对于鲜切加工和外源ATP处理对鲜切黄瓜品质和活性成分积累的影响还鲜见研究报道。为此，本实验先对不同浓度外源ATP处理对鲜切黄瓜贮藏期间的品质及总酚和GABA含量变化的影响进行研究，同时研究外源ATP通过苯丙烷类代谢、GABA支路及多胺降解途径调控活性成分富集的可能机制，以期为鲜切黄瓜的保鲜及利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

挑选大小均匀、无损伤和成熟度一致的新鲜‘绿翠2号’黄瓜，购买后立即运回实验室。

氯化镧、ATP、L-苯丙氨酸、辅酶A 南京梅林学海生物科技有限公司；β-巯基乙醇、亮抑酶肽、p-香豆酸 南京菲亚生物科技有限公司；氧化型辅酶II钠盐、二硫苏糖醇、N,N-二甲基苯胺 南京迈博生物科技有限公司；苯甲酰氯、辣根过氧化物酶、L-谷氨酸南京丁贝生物科技有限公司；谷氨酸脱氢酶、腐胺、亚精胺、精胺 南京晶格化学科技有限公司。

1.2 仪器与设备

TA-XT2i型质构仪 美国FTC公司；UV-1600型分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；CR-400型色差仪 日本Minolta公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅医疗生物仪器有限公司；LC-20A高效液相色谱仪 日本岛津有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料处理

将挑选好的黄瓜用蒸馏水清洗表面上细刺后于200 μL/L次氯酸钠溶液中浸泡5 min，去皮后用消毒好的搓丝板将黄瓜刨成6 cm×0.2 cm×0.2 cm的丝状，分别用0（蒸馏水，对照（CK））、0.8、1.2、1.6、2.0 mmol/L ATP溶液浸泡10 min，晾干后用19 cm×12 cm×4.5 cm塑料保鲜盒包装，每盒约100 g，外覆聚乙烯薄膜包裹后置于10 ℃环境中贮藏，在贮藏的6、12、24、48 h和72 h时取样，一部分用于物理指标测定，另一部分经液氮速冻后测定相关代谢指标。预实验结果表明，1.6 mmol/L ATP处理可最有效地延缓鲜切黄瓜贮藏期间品质下降和促进总酚和GABA合成，因此选择此浓度处理进行后续机理研究。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 色泽和菌落总数

参照Fan Kai等[22]的方法，采用色差仪测定L值。菌落总数的测定参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》。

1.3.2.2 硬度和抗坏血酸含量

采用探头直径为2 mm的TA-XT2i型质构仪测定鲜切黄瓜硬度，参照Zambrano-Zaragoza等[23]的检测参数并稍加修改：穿刺深度1.5 mm、穿刺速率100 mm/min、触发力0.5 N，硬度单位为N。抗坏血酸含量的测定参考曹建康等[24]的邻菲罗啉比色法，单位为mg/100 g。

1.3.2.3 总酚含量

总酚含量测定参考赵磊等[25]的方法，单位为mg/kg。

1.3.2.4 苯丙氨酸解氨酶、4-香豆酸辅酶A连接酶和肉桂酸羟化酶活力

参照Ke等[26]的方法测定苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活力，称取1 g黄瓜冻样，加入5 mL含有40 g/L聚乙烯吡咯烷酮、2 mmol/L乙二胺四乙酸、5 mmol/Lβ-巯基乙醇的100 mmol/L硼酸-硼砂缓冲液（pH 8.8）研磨至匀浆，于12 000×g、4 ℃离心15 min得到上清液。取3 mL上述硼酸缓冲液和0.5 mL 20 mmol/LL-苯丙氨酸溶液混合，37 ℃反应10 min后再加入1 mL上清液，涡旋后迅速保温60 min，测定保温前后在290 nm波长处的吸光度，以每分钟吸光度变化0.001定义为一个PAL活力单位（U）。4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）和肉桂酸羟化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）活力参考Wang Li等[27]的方法测定，分别以体系每分钟在333 nm和340 nm波长处吸光度变化0.001定义为一个4CL、C4H活力单位（U）。

1.3.2.5 GABA和谷氨酸含量

GABA含量测定参照Wang Kaikai等[28]的方法并略有改动。反应体系涡旋混匀后于室温下放置6 min，经沸水浴10 min、冰浴5 min终止反应，最后加入800 μL体积分数60%乙醇溶液后于20 ℃保温20 min，测定645 nm波长处吸光度,并以BABA标准品溶液绘制标准曲线，进而计算样品中的BABA含量，单位为mg/g。谷氨酸（glutamate，Glu）含量参考Al-Quraan等[29]的方法测定。将研钵预冷后称取1 g黄瓜冻样，加入3 mL 75%甲醇溶液研磨成匀浆，4 ℃、12 000×g离心15 min。取20 μL上清液，加入200 μL 100 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.3，含有7.5 mmol/Lβ-NAD＋和1 U/mL谷氨酸脱氢酶）混匀后于30 ℃反应1 h，测定340 nm波长处反应前后的吸光度变化，并以谷氨酸标准品溶液绘制标准曲线，进而计算样品中的谷氨酸含量，单位为mg/g。

1.3.2.6 谷氨酸脱羧酶活力

参考Li Dong等[30]的方法测定谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）活力。反应体系为0.2 mL粗酶液和0.5 mL 0.1 mol/L pH 5.8磷酸钾缓冲液（内含3 mmol/LL-谷氨酸、40 μmol/L磷酸吡哆醛），终止反应后吸取0.5 mL上清液，根据1.3.2.5节方法测定GABA含量，以每小时生成1 μmol GABA定义为一个GAD活力单位。

1.3.2.7 腐胺、亚精胺和精胺含量

多胺含量测定参照Madebo等[31]的方法。称取3 g黄瓜冻样，加入5 mL、体积分数5%预冷的高氯酸溶液研磨至匀浆后于冰箱中4 ℃浸提1 h，12 000×g、4 ℃离心25 min。将上清液和2 mol/L氢氧化钠溶液各2 mL与10 μL苯甲酰氯混匀30 s，37 ℃水浴20 min，再加入饱和氯化钠和无水乙醚各2 mL，混匀后吸取1 mL醚相进行氮吹，再加入1 mL无水乙醚进行二次氮吹，吹干后加入0.4 mL色谱级甲醇涡旋溶解洗出多胺，过0.22 μm有机滤膜后进行高效液相色谱测定。色谱条件：流动相：色谱级甲醇-水（65∶35，V/V），流速0.8 mL/min，柱温30 ℃，进样量20 μL，色谱柱为C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），检测波长254 nm，单位为nmol/g。

1.3.2.8 4-氨基丁醛脱氢酶、二胺氧化酶和多胺氧化酶活力

4-氨基丁醛脱氢酶（4-amino aldehyde dehydrogenase，AMADH）活力参考Wang Kaikai等[28]的方法测定。反应体系为0.5 mL上清液和2 mL 0.1 mol/L pH 8.0磷酸钾缓冲液（内含1 mmol/L NAD＋、1 mmol/L 4-氨基丁醛），30 ℃孵育20 min，以340 nm波长处反应前后吸光度每分钟变化0.001定义为一个AMADH活力单位（U）。二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）和多胺氧化酶（polyamine oxidase，PAO）活力测定参考Li Ziying等[32]的方法，均以反应体系每分钟在555 nm波长处吸光度变化0.001定义为一个DAO、PAO活力单位。

1.4 数据统计与分析

以上指标测定均取3 个平行样，每个样3 次重复，所有指标均以鲜质量计。采用SAS 8.1软件进行统计分析，并利用Origin Pro 8.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同浓度ATP处理对鲜切黄瓜品质的影响

鲜切黄瓜呈浅绿色，但随着贮藏时间延长表面颜色逐渐变暗，影响感官品质和食用价值。L值表示明亮度，可以反映鲜切黄瓜颜色变暗程度，由图1A可知，鲜切黄瓜贮藏期间L值呈下降趋势，ATP处理能延缓L值的下降，维持鲜切黄瓜的色泽，其中1.6、2.0 mmol/L ATP处理效果最佳。

图1 不同浓度ATP处理对鲜切黄瓜L值（A）、菌落总数（B）、硬度（C）和抗坏血酸含量（D）的影响Fig. 1 Effects of different concentrations of ATP treatment on L value (A),total bacterial count (B), firmness (C) and ascorbic acid content (D) of fresh-cut cucumber

鲜切黄瓜因切分导致的组织损伤易导致微生物滋生，菌落总数可以反映其受微生物侵染的程度。由图1B可知，鲜切黄瓜贮藏期间菌落总数不断上升，对照组贮藏72 h后菌落总数比初始值增加了2.59（lg（CFU/g）），但贮藏结束后各组鲜切黄瓜菌落总数均小于106CFU/g，仍然在安全可食用范围中。ATP处理组菌落总数明显低于对照组，说明ATP处理能有效抑制鲜切黄瓜微生物生长，但不同处理浓度组间无显著差异。

硬度是反映鲜切黄瓜新鲜度和感官品质的重要指标。如图1C所示，鲜切黄瓜硬度在贮藏前期迅速下降，后期趋于稳定。ATP处理可以有效延缓鲜切黄瓜硬度的降低，保持脆嫩口感，其中1.6 mmol/L ATP处理组的硬度在整个贮藏过程中均高于其他处理组。

抗坏血酸含量是反映果蔬营养品质的主要指标。如图1D所示，鲜切黄瓜抗坏血酸含量变化趋势与硬度相似，前期下降较快，后期趋于平缓。整个贮藏过程中，ATP处理组的抗坏血酸含量均比对照组高，表明ATP处理能减缓抗坏血酸含量降低，其中1.6、2.0 mmol/L ATP处理能较好地抑制抗坏血酸含量的损失。

2.2 不同浓度ATP处理对鲜切黄瓜总酚和GABA含量的影响

由图2A可知，鲜切黄瓜贮藏期间总酚含量呈先升高后降低的趋势，除2.0 mmol/L ATP处理外，其他组均于贮藏48 h时达到最高值。在整个贮藏期间ATP处理组总酚含量均比对照组高，说明ATP处理促进了鲜切黄瓜中总酚的合成，且能使总酚含量在贮藏前期上升较快。其中1.6 mmol/L ATP处理对促进总酚积累的效果最佳，在贮藏48 h后总酚含量明显高于其他处理组。由图2B可知，鲜切黄瓜贮藏期间GABA含量呈先上升后下降并趋于稳定的趋势，除2.0 mmol/L ATP处理组外，其他组在6 h时达到峰值。不同浓度ATP处理均可提高鲜切黄瓜GABA含量。整体来看，1.6 mmol/L ATP处理对提高GABA含量的效果最好。

图2 不同浓度ATP处理对鲜切黄瓜总酚（A）和GABA（B）含量的影响Fig. 2 Effects of different concentrations of ATP treatment on total phenolic content (A) and GABA content (B) of fresh-cut cucumber

综合上述结果可知，1.6 mmol/L ATP处理能最有效地延缓鲜切黄瓜品质下降及提高总酚和GABA的含量，因此，选用此浓度处理进行后续ATP促进鲜切黄瓜活性成分积累的机理研究。

2.3 1.6 mmol/L ATP处理对鲜切黄瓜苯丙烷类代谢关键酶活力的影响

酚类物质合成主要通过苯丙烷类代谢途径，PAL、4CL和C4H是催化酚类物质合成的关键酶。如图3所示，鲜切黄瓜在贮藏期间PAL、4CL和C4H活力均呈先升高后降低的趋势，在整个贮藏期间ATP处理组的PAL、4CL和C4H活力显著高于对照组，表明ATP处理能激活鲜切黄瓜苯丙烷类代谢关键酶活力，从而促进酚类物质的合成与积累。

图3 ATP处理对鲜切黄瓜PAL（A）、4CL（B）和C4H（C）活力的影响Fig. 3 Effect of ATP treatment on PAL (A), 4CL (B) and C4H (C)activities of fresh-cut cucumber

2.4 1.6 mmol/L ATP处理对鲜切黄瓜GABA支路的影响

植物中GABA的主要合成途径为GABA支路，Glu在GAD的作用下脱羧生成GABA。如图4A所示，鲜切黄瓜贮藏期间Glu含量先下降后上升并趋于稳定。在整个贮藏期间ATP处理组的Glu含量明显低于对照组，贮藏6 h时比对照组减少了15.6%，说明ATP处理促进了Glu的降解。由图4B可知，鲜切黄瓜贮藏期间GAD活力呈先上升后下降的趋势，在6 h达到峰值，在整个贮藏期间ATP处理组的GAD活力显著高于对照组，说明ATP处理可以促进Glu向GABA的转化。综上，ATP处理能激活鲜切黄瓜中GABA支路代谢关键酶活力，促进Glu降解从而合成GABA。

2.5 1.6 mmol/L ATP处理对鲜切黄瓜多胺降解途径的影响

GABA合成的另一条重要途径为多胺降解，它是指多胺在DAO、PAO催化下产生γ-氨基丁醛，再经AMADH作用生成GABA的过程。如图5A～C所示，鲜切黄瓜贮藏期间腐胺、亚精胺和精胺3 种多胺含量前6 h均迅速下降，随后稍有回升后又缓慢下降，ATP处理组3 种多胺的含量均比对照组低，说明ATP处理促进了多胺的降解。由图5D～F可知，贮藏期间鲜切黄瓜DAO、PAO和AMADH活力总体呈先上升后下降的趋势，在整个贮藏期间ATP处理组的这3 种酶活力明显高于对照组，说明ATP处理可以促进多胺向GABA的转化。综上，ATP处理可通过提高鲜切黄瓜中多胺降解途径关键酶活力促进多胺降解，从而合成GABA。

图5 ATP处理对鲜切黄瓜腐胺含量（A）、亚精胺含量（B）、精胺含量（C）、DAO活力（D）、PAO活力（E）和AMADH活力（F）的影响Fig. 5 Effect of ATP treatment on putrescine content (A), spermidine content (B), spermine content (C), DAO activity (D), PAO activity (E)and AMADH activity (F) of fresh-cut cucumber

3 讨 论

黄瓜鲜切加工后内部组织结构受到破坏，导致营养汁液外流和果肉大面积暴露在空气中，从而促进果肉软化、表面颜色变暗和微生物的增殖，进而加速品质劣变，降低商品性和食用价值。能量是新鲜果蔬生命活动的基础，果蔬采后能量亏损会导致活性氧积累及细胞膜结构完整性受损，进而促进组织褐变、质地软化和腐烂等果蔬衰老和品质劣变的发生[33]。已有研究报道，外源ATP处理能影响果蔬采后能量水平，进而调控衰老和品质劣变进程。如外源ATP处理能降低羊肚菌贮藏期间的菌落总数，提高呈香物质含量，保持较好的品质[34]。Chen Lin等[7]研究发现ATP处理可有效降低绿豆芽褐变程度，并保持较高的抗坏血酸含量，延长贮藏期。Li Meiling等[35]发现ATP处理可抑制龙眼果实细胞膜透性和褐变指数的上升，从而延缓果实采后衰老褐变。外源ATP处理也可提高冷藏南果梨果实中内源ATP含量和能荷水平，有效延缓呈香物质含量的下降，维持其风味品质[36]。本实验中，不同浓度ATP处理可以有效保持鲜切黄瓜色泽，延缓菌落总数上升，抑制硬度和抗坏血酸含量下降，从而改善贮藏品质，延长货架期，其中1.6 mmol/L ATP处理对品质维持效果最佳，因此在鲜切黄瓜贮藏保鲜中具有广泛的应用价值。

研究表明，胞外ATP可能作为一种信号分子与质膜上的特异受体结合，提高胞质游离钙离子的含量，激活NADPH氧化酶活性，诱导活性氧产生，从而激活苯丙烷类代谢途径，促进酚类物质的合成积累[37]。酚类化合物是果蔬中重要的次生代谢产物，果蔬鲜切后会产生应激反应导致多酚类物质合成积累以抵御损伤胁迫，同时提高产品的抗氧化活性和营养价值[38]。酚类物质主要通过苯丙烷类代谢途径产生，莽草酸和苯丙氨酸在PAL、C4H和4CL等酶的催化作用下转化为酚酸和黄酮类化合物[18]。研究表明，外源ATP处理可维持果蔬采后较高的总酚含量和抗氧化活性。如Aghdam等[39]发现ATP处理能显著提高双孢蘑菇中PAL活力，同时降低多酚氧化酶活力，从而促进总酚含量增加，延缓其衰老进程。采用外源ATP处理可以维持龙眼较高的类黄酮和总酚含量，同时抑制多酚氧化酶活性和果实褐变[5]。绿豆芽经ATP处理后多酚氧化酶活力降低，总酚含量提高，从而有利于抑制褐变和维持品质[7]。本实验中，1.6 mmol/L ATP处理可提高鲜切黄瓜贮藏期间PAL、4CL和C4H的活力，促进酚类物质的合成积累，进而提高总酚含量。综上，外源ATP处理可能作为信号分子促进活性氧产生，进而通过提高苯丙烷类代谢途径中关键酶活性来促进鲜切黄瓜中酚类物质的合成积累，从而提高其抗氧化活力和营养价值。

植物在遭受逆境胁迫时GABA会迅速积累使得植物胁迫耐受性更强[40]。高等植物中有两条合成GABA的途径，分别为GABA支路和多胺降解途径，GAD为GABA支路的关键酶，其活性受钙离子调控，而DAO和PAO等胺氧化酶及AMADH是多胺降解途径的关键酶[41]，无论哪条途径，GABA合成的生化反应都需要能量保障。ATP处理也有可能作为信号分子通过激活钙离子等第二信使的产生来调控各种细胞反应，近年来的研究表明，鲜切加工和CaCl2处理可提高这些GABA合成关键酶的活性，促进鲜切梨[14]、莴苣[17]、胡萝卜[28]和火龙果[42]等鲜切果蔬产品中GABA的积累。本实验中，1.6 mmol/L ATP处理可提高鲜切黄瓜贮藏期间GAD、DAO、PAO和AMADH的活力，促进Glu和多胺向GABA转化，进而提高鲜切黄瓜中GABA含量。鲜切黄瓜贮藏前期Glu含量呈下降趋势，说明Glu可能被迅速消耗生成GABA，随后Glu含量上升可能是因为GABA转化形成的琥珀酸进入三羧酸循环生成Glu。ATP处理组多胺含量在贮藏过程中先迅速下降，随后稍有回升后又缓慢下降，可能是因为ATP处理提高了贮藏前期胺氧化酶和AMADH活力，促进多胺降解合成GABA，之后逆境胁迫生成的多胺大于分解，多胺含量上升，但随着贮藏时间延长，果蔬衰老导致产生的多胺含量减少，最后呈下降趋势。上述实验结果表明，ATP处理能激活鲜切黄瓜中GABA支路和多胺降解途径关键酶活性，促进Glu和多胺分解，进而提高GABA含量。但ATP处理通过促进GABA合成关键酶活性进而促进果蔬中GABA的合成积累的机理尚鲜有相关文献报道，是否是因为外源ATP处理提高了果蔬中内源ATP水平或作为信号分子诱导钙离子浓度升高进而调控GABA代谢有待进一步研究。

综上，1.6 mmol/L ATP能有效保持鲜切黄瓜较好的色泽和较低的菌落总数，维持较高的果实硬度和抗坏血酸含量，从而延缓品质下降；同时1.6 mmol/L ATP处理可激活苯丙烷类代谢途径和GABA代谢途径中关键酶活性，促进总酚和GABA等活性成分的合成积累，提升鲜切黄瓜抗氧化活性和潜在的营养价值。