牛膝治疗糖尿病周围神经病变的作用机制

童雅琴 肖文惠 牟彦竹 张迎庆

［收稿日期］20211021

［第一作者］童雅琴（1998-），女，湖北宜昌人，湖北工业大学硕士研究生，研究方向为药剂学

［通信作者］张迎庆（1969-），女，湖北蕲春人，药学博士，湖北工业大学教授，研究方向为天然药物

［文章编号］1003-4684（2023）02-0044-05

［摘要］为探讨中药牛膝治疗糖尿病周围神经病变的机制，分别采用网络药理学及分子对接，对牛膝治疗糖尿病周围神经病变的活性成分进行预测。研究结果表明：网络药理学分析，筛选得到牛膝对糖尿病周围神经病变治疗有效成分11种，关键靶点主要为AKT1 、IL-6、CASP3和 VEGFA。功能富集分析结果表明，牛膝可能通过协同调节HIF-1、MAPK、Fox0等多种生物途径来治疗糖尿病周围神经病变。分子对接结果表明，红厚壳内酯是一种具有良好分子对接性能的先导化合物。本研究阐明了牛膝治疗糖尿病周围神经病变的活性成分和作用机制，为寻找治疗糖尿病周围神经病变的先导化合物和新药研发提供了理论依据。

［关键词］牛膝； 糖尿病周围神经病变； 网络药理学； 分子对接

［中图分类号］R285  ［文献标识码］A

糖尿病周围神经病变（diabetic peripheral neuropathy，DPN）属于糖尿病的常见慢性并发症之一，致残率高，对患者的睡眠、情绪等产生负面影响，导致其生活质量下降。研究表明，糖尿病病程越长，DPN的发病率越高，会给整个卫生保健系统和整个社会带来沉重的经济负担[1]。

DPN主要分为周围神经病变和自主神经病变。DPN临床患者多有双侧对称性麻木的症状，疼痛表现为刺痛、灼痛，多于夜间加重，同时伴有四肢发凉和麻木感。若伤及运动神经，患者还会出现不同程度的肌力减退，肌腱反射消失等情况。自主神经病变患者会影响心脏功能、胃肠道功能和泌尿生殖系统功能等方面的生理活动[2]。DPN的发病机制比较复杂，即使该病在临床上很常见，但其具体发病机制到目前为止仍不明确，大部分研究人员认为DPN与神经营养因子缺乏密切相关[3]。最近有学者提出DPN的发病机制可能与感觉神经元及信使核糖核酸（mRNA）的变化有关[4]。

目前，国外治疗DPN开始专注于改善患者能量代谢的过程，包括提高患者氧化应激反应能力等[5]。中医药防治DPN具有明显优势，且安全性高，已成为临床、科研和新药研发热点[6]。中医药治疗DPN的方法包括中药汤剂治疗、中药注射液、针灸疗法、中医外治疗法等，可有效缓解DPN患者的临床症状[7]。近年来，中药在治疗DPN上临床疗效较好，也越来越受到关注[8]。

中国药典收载牛膝为苋科植物牛膝（Achyranthes Bidentata Blume）的干燥根。牛膝具有活血祛淤、补肝肾、引血下行的功效，临床用于淤血阻滞的月经不调、下肢无力等症，对心血管系统、免疫系统、血液系统和神经内分泌系统等都有一定的作用[9]。牛膝在临床上可与黄芪、白术等配伍用于治疗DPN[10]。研究表明，牛膝提取物具有明显的降血糖作用，可在一定程度上降低Ⅱ型糖尿病大鼠胰岛素抵抗程度，提高其抗氧化能力，改善糖代谢[11]。

本研究目的在于通过中药网络药理学和分子对接的方法，探究牛膝对DPN的作用机制，并且结合文献，对所得到的化学成分、关键靶点、信号通路等信息进行分析，为以后深入研究提供理论基础。

1    实验材料及方法

1.1    化学成分筛选及化学成分潜在靶点收集

本研究采用TCMSP数据库（https：∥tcmspw.com/tcmsp.php）检索牛膝相关的潜在靶点。以口服生物利用度（OB）和类药性（DL）为筛选指标评价所选出来的化合物，DL值越高，通常表示成分越可能成为药物。过滤条件为生物利用度大于30%，同时类药性大于0.18的化学成分。

1.2    DPN疾病靶点的筛选

利用 GeneCards （ https：∥www.genecards.org/）数据库，检索DPN疾病相关基因。GeneCards是人类基因的综合数据库，可以提供所有已知和预测的人类基因。

1.3    蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

利用R软件，绘制牛膝与疾病靶点的维恩图，得到相关表格数据，利用网络图像化软件Cytoscape3.7.2构建药物调控网络，利用String软件进行PPI网络的构建及分析。

1.4    GO和KEGG富集分析

为了进一步了解上述筛选出的靶标蛋白基因的功能，以及在信号通路中的作用，将篩选得到的靶点，进行GO（Gene Ontology）生物学过程富集分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信号通路富集分析。为了使结果具有统计学意义，入选条件为P<0.05，以GO（BP）结果前20位与KEGG结果前20位进行展示。

1.5    成分靶点分子对接

在以上结果基础上，选择PPI网络中“degree”最大的靶点作为受体，将潜在靶点蛋白名称输入UniProtKB数据库（https：∥www.uniprot.org/）和PDB数据库（https：∥www1.rcsb.org/），找到相应蛋白的结构，并且利用PyMol软件进行去水和去除残基处理。在TCMSP数据库（https：∥tcmspw.com/tcmsp.php）和Pubchem （https：∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 检索筛选所有对应靶点的化合物2D结构。利用PyMol软件和ChemBio3D软件将所得分子结构进行修饰处理。利用AutoDockvina进行蛋白分子加氢处理，找到相应的活性口袋，然后依次进行分子对接，得到分子对接得分数据。

2    实验结果分析

2.1    牛膝主要活性成分筛选

通过分析平台检索到牛膝中化合物成分，根据参考条件筛选出成分17个，包括：槲皮素、山柰酚等黄酮类成分；黄连碱、表小檗碱等生物碱类成分；菠甾醇、菠甾醇、B-谷甾醇和豆甾醇等甾醇类成分；蜕皮甾酮等甾酮类成分（表1）。

2.2    牛膝活性成分DPN靶点交集图

牛膝治疗DPN潜在作用靶点的预测研究共筛选到牛膝有效成分作用靶点183个，DPN疾病靶点1522个。药物与疾病靶点的交集图见图1。由图1a可见，两者交集靶点共92个。由图1b可见，在该网络中，共包含节点105个，其中牛膝（drug）、DPN节点各1个，牛膝有效成分节点11个（表1内17个牛膝有效成分中，有6个成分无对应的DPN靶点）分别是槲皮素、山柰醇、汉黄芩素、黄连素、黄连碱、黄芩素、表小檗碱、β-谷甾醇、海棠果素E、豆甾醇和大黄藤素。对应靶点较多的成分为槲皮素，对应83个靶点，提示牛膝中治疗DPN的关键成分可能为槲皮素。其次为山柰醇和汉黄芩素。与这些成分相连接的靶点数目比较靠前，在牛膝治疗DPN的过程中，这些成分比较重要。牛膝治疗DPN潜在作用靶点共 92 个。

图 1    牛膝活性成分治疗DPN潜在靶点网络

2.3    关键作用靶点的PPI网络分析

牛膝治疗DPN 的PPI网络见图2，由图2a可见，该网络中共有节点数为92，边数为1616，平均节点度为35.1，平均局部聚类系数为0.688。牛膝治疗DPN的关键靶点见图2b，可见节点度值较高的靶点蛋白包括AKT1、IL6、VEGFA、CASP3和JUN等，它们可能在牛膝治疗DPN中发挥关键作用。

2.4    GO富集分析结果及KEGG富集结果分析

将功能相似的基因进行富集整理，将P值从大到小排列。图3中，横轴代表基因的数目，颜色代表不同功能之间的显著性差异。通过GO共富集到BP141个条目，将生物学功能较前的20个条目进行排名，结果如图4所示。其中，细胞因子结合活性共14个靶点，细胞因子活性有 12 个靶点，磷酸酶结合靶点为11个，还有核受体的活性和转录因子活性等。通过KEGG富集到了多个信号通路，牛膝治疗DPN主要集中在HIF-1、MAPK信号通路、Fox0信号通路、内分泌抵抗、NF-κB信号通路，表明牛膝治疗DPN的过程是多通路协调的过程。这些通路可以作为后期牛膝治疗DPN的研究方向，其中MAPK信号通路与DPN相关靶点数目最多。

2.5    分子对接结果分析

结合前期的分子对接研究基础，选取靶点疾病关键靶点AKT1（PDBID：3o96），分别与11个化合物进行分子对接，对接结果如表2所示。可以看出，虽然槲皮素（Quercetin）是靶点最多的化合物，但其与AKT1的结合能力不如红厚壳内酯（Inophyllum E）稳定。虽然目前对红厚壳内酯的研究较为局限，但其是一种具有良好分子对接性能的先导化合物。选择最优的对接结果进行可视化作图（图5）。图5中绿色的是晶体结构里面的原有配体，蓝色部分是化合物分子，可以看出二者结合位置相近，红色标注出来的是有关键作用的残基，说明红厚壳内酯（Inophyllum E）通过与AKT1的ASP-292、LYS-268、SER-205 残基进行对接。

图5中虚化部分是蛋白晶体结构，红色标注出来的是有关键作用的残基，绿色的是晶体结构里面的原有配体，蓝色的是红厚壳内酯（Inophyllum E）化合物分子。

3    讨论与结论

牛膝属于活血化瘀类药物，在治疗DPN中起着重要的作用[12]。实验结果共筛选得到了11个活性成分，其中已经有文献证实的能够治疗DPN且有实验研究的成分有槲皮素、黄连素、黄芩素[13-14]；少量文献表示黄连碱、表小檗碱、β-谷甾醇等有一定的降糖作用，但未研究其与DPN的关系[15]；汉黄芩素，红厚壳内酯，山柰醇，豆甾醇，大黄藤素与糖尿病及其并发症的研究暂无报道。结果提示，槲皮素为牛膝治疗DPN过程中靶点最多的成分，其次是山柰醇和汉黄芩素，这些成分在牛膝治疗DPN的过程中可能有主导作用。

在治疗DPN的过程中，起着重要作用的靶点为AKT1、IL-6、VEGFA和CASP3。通过文献查阅，本研究所得的牛膝治疗DPN的相关重要靶点和治疗机制已得到部分验证。其中AKT1是AKT激酶的3种紧密相关蛋白激酶之一[16]，研究显示与AKT1相关的牛膝成分有槲皮素和β-谷甾醇等。IL-6即白细胞间介素-6，在免疫细胞的成熟、活化、增殖和免疫调节等一系列过程中均发挥重要作用[17]，研究显示调节IL-6相关的牛膝成分为槲皮素和汉黄芩素等。临床上治疗DPN的药物依帕司他，可明显改善患者临床症状，降低血清IL-6[18]，槲皮素、汉黄芩素与依帕司他作用靶点相同。CASP3是一种与细胞凋亡信号通路有关的重要的酶。细胞凋亡受到细胞内凋亡调节蛋白的调控，Caspase家族是细胞凋亡过程中发挥关键作用的一组半胱氨酸蛋白酶，而其中的CASP3在凋亡级联反应中是最为关键的凋亡蛋白酶[19]。本研究中与CASP3相关牛膝成分有槲皮素和山柰酚等，其中槲皮素可能会激活CASP3信号通路促进细胞的凋亡，通过抑制CASP3的活性，可以减少高糖诱导的细胞凋亡，控制血糖平穩。

牛膝治疗DPN主要集中在HIF-1信号通路、MAPK信号通路和Fox0信号通路等。与免疫炎症系统HIF-1信号通路相关的靶点基因包括AKT1、BCL2、IL-6、NOS2、RELA、VEGFA等。HIF-1信号通路是KEGG富集的所有通路中显著性最高的通路，HIF-1信号通路在调节血管的生成、葡萄糖代谢及细胞的凋亡和自噬方面具有重要作用[20]。MAPK信号通路与糖尿病的异常代谢有关。与该通路相关的靶点在本实验中有24个，包括MAPK14、RELA、AKT1、JUN等，与牛膝中多个成分相关。已有文献报道证实，槲皮素可以增加 MAPK 的表达水平和促进 MAPK磷酸化来上调葡萄糖转运载体的表达，促进糖的吸收和利用，增加胰岛素受体的敏感性，改善胰岛素抵抗[21]  。FoxO信号通路是胰岛素转导中一个关键信号通路，FoxO是Forkhead box（ Fox）大家族中的0亚族，在代谢紊乱、人类寿命和肿瘤抑制中发挥重要作用。Fox0蛋白因子是胰岛素信号通路的最终效应因子，通常通过诱导肝脏中的糖异生、抑制脂肪细胞和心肌细胞分化，或将肌肉中的燃料利用从葡萄糖转移到脂质来应对营养物质的减少[22]。因此，Fox0蛋白的失调与胰岛素抵抗、饮食肥胖和2型糖尿病的发病机制有关。根据实验结果推测牛膝可以通过调控AKT1、IL-6等靶点来上调FoxO表达量，起到对β细胞氧化应激的保护作用[23]。

有效预防和控制糖尿病及其并发症疾病发生，一直是国内外生物医学科学领域的国家需求。本研究通过网络药理学、分子对接探讨了牛膝在治疗DPN的过程中的作用机制，发现牛膝中的槲皮素、汉黄芩素、红厚壳内酯等活性成分值得进一步深入研究，为临床上牛膝治疗DPN及相关药物研发提供了新的理论依据。

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The Mechanisms of Achyranthes Bidentata Blume inTreating Diabetic Peripheral Neuropathy

TONG Yaqin， XIAO Wenhui， MU Yanzhu， ZHANG Yingqing

（School of Biological Engineering and Food， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068， China）

Abstract：To systematically investigate the mechanisms of Achyranthes Bidentata Blume in treating diabetic peripheral neuropathy.Methods： In this study， network pharmacology， molecular docking analysis were used to predict the active components of Achyranthes Bidentata Blume in the treatment of DPN.Results： The network analysis showed that there were 17 active components of Achyranthes Bidentata Blume in treating DPN. And the key targets were AKT1 IL 6， CAPSP3 and VEGFA. The functional enrichment analysis indicated that  Achyranthes Bidentata  Blume may treat DPN by synergistically regulating many biological pathways， such as HIF 1， MAPK and Fox0 signaling pathway， etc. In addition， the results of molecular docking showed that Inophyllum E might be a promising leading compound with good molecular docking performance. Conclusions： The active components and mechanism of action of diabetic peripheral neuropathy were fully elucidated in this study， and laid a foundation for finding lead compounds of DPN and developing new drugs for the treatment of DPN.

Keywords：Achyranthes Bidentata Blume；diabetic peripheral neurpthy；network pharmacology; molecular docking

［責任编校： 张众］