三株球孢白僵菌对小菜蛾室内毒力测定

王砚妮 李敏 段先莉 龙同 李文静 赵锦芳

［收稿日期］20211112

［基金项目］农业部华中作物有害生物综合治理重点实验室开放基金项目（2019ZTSJJ3）；湖北省教育厅重点项目（D20201403）；湖北省自然科学基金（2019CFB604）；湖北省新世纪高层次人才工程项目（鄂人社函［2018］666号）；大学生创新创业训练计划（S202110500049）

［第一作者］王砚妮（1996-），女，湖北宜昌人，湖北工业大学硕士研究生，研究方向为微生物

［通信作者］赵锦芳（1980-），女，山东威海人，湖北工业大学副教授，研究方向为微生物

［文章编号］1003-4684（2023）02-0040-04

［摘要］为发掘生防潜力，以小菜蛾为供试昆虫，对从湖北省恩施州所采草地贪夜蛾僵蚕体上分离获得的三株球孢白僵菌Bbyn-1、Bbyn-2和Bbyn-3进行室内毒力测定。结果表明，当孢子悬浮液浓度为1×108个/mL时，接种7 d后菌株Bbyn-1的毒力最高累计死亡率为97.66%；当孢子悬浮液浓度为1×108个/mL、接种量150 μL时，接种7 d后菌株Bbyn-1的毒力最高为99.67%；浸虫法接种7 d后菌株Bbyn-3的毒力最高为96.94%；涂抹法接种7 d后菌株Bbyn-2的毒力最高为93.71%。与球孢白僵菌菌株Bbyn-2和Bbyn-3相比，菌株Bbyn-1有较高的致病力，具有进一步研究和开发的潜力。

［关键词］球孢白僵菌； 毒力测定； 小菜蛾

［中图分类号］S476.12  ［文献标识码］A

小菜蛾（Plutella xylostella），俗称“吊丝虫、两头尖”，是一种世界性的重要害虫，主要危害十字花科蔬菜[1-3]。其为害特点：世代周期短，繁殖力、迁移、抗逆能力和适应性强[4-5]。对小菜蛾的防控主要依赖于化学农药，但化学农药使其产生了严重的抗药性[6]，破坏了田间的生态平衡，同时也严重影响蔬菜的产量和品质[7]。因此开展小菜蛾的生物防治已成为人们探索控制其危害的重要途径。

球孢白僵菌是一种虫生真菌，可通过体壁侵染寄生昆虫，数量多达750多种[8]。在自然界中发现的由白僵菌致病死亡的昆虫约占20%，如小菜蛾、草地贪夜蛾、西花蓟马、桃蚜、松褐天牛等[9-11]。球孢白僵菌的低毒低残留、强致病力、高专一性及不易产生抗药性被广泛用于害虫的防治[12]。在我国，已应用白僵菌防治40多种害虫获得成功，年防治面积在67万hm2以上[3]。

本研究以分离的3株球孢白僵菌菌株为试材，对小菜蛾进行室内毒力测定，比较不同接种方式的杀虫效果，筛选出高毒力菌株，为今后更好地开展生防试验提供数据参考。

1    材料与方法

1.1    供试菌株

供试菌株球孢白僵菌株系Bbyn-1、Bbyn-2、Bbyn-3，由自湖北省恩施州所采草地贪夜蛾僵蚕体上分离筛选获得，保藏于湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室。

1.2    供试昆虫

昆虫饲喂实验在湖北省农业科学院生物农药工程研究中心昆虫培养室开展，选取鳞翅目小菜蛾的2龄健康无污染幼虫作为供试虫源，室内饲养条件为（27±2）℃，相对湿度60%～90%。

1.3    供试对照试验药剂

0.1%的Tween-80无菌水作为空白对照CK1。

化学农药杀虫剂陶氏益农艾绿士购自临沂庆丰年农资有限公司。原药用体积分数为0.1%的Tween-80水溶液稀释1000倍，作为溶剂对照CK2。

1.4    供试培养基与人工饲料

PDA培养基：200 g马铃薯加水煮沸过滤至1000 mL，分别加入20 g的葡萄糖和20 g的琼脂。

人工饲料的配方参照杨亚军[13]的方法：小麦粉280 g、大豆粉90 g、酵母粉35 g、琼脂25 g、复合维生素B 0.2 g、胆固醇12 g、山梨酸2 g、抗坏血酸12 g、对羟基苯甲酸甲酯5 g、甲醛4 mL、青霉素0.2 g、无菌水1500 mL。

1.5    孢子悬浮液制备

将3株球孢白僵菌菌株接种于PDA上培养至产孢，真菌孢子用0.1%的Tween-80无菌水配制为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104个/mL的悬浮液，作为供试菌液。

1.6    接种方式

1.6.1    不同浓度的饲料浸润法在24孔养虫孔板的每孔中加入配制好的孢子悬浮液100 μL，轻轻摇动使其在饲料表面形成均匀的药膜，自然风干后接入整齐健康的小菜蛾2龄幼虫，每孔接虫3头，每个处理72头虫，3次重复。设置CK1与CK2。

1.6.2    不同接种量的饲料浸润法在养虫孔板中分别加入浓度为108个/mL的孢子悬浮液50、100、150、200 μL。其余操作同1.6.1。

1.6.3    浸虫法用软毛笔将供试小菜蛾2龄幼虫挑入浓度为108个/mL的孢子悬浮液中，浸渍20 s后挑出，幼虫置于滤纸上吸去多余水分。然后将其接入含有饲料的24孔养虫孔板中，每孔接虫3头，每个处理72头虫，3次重复。设置CK1与CK2。

1.6.4    涂抹法将幼虫置于滤纸上，用软毛笔蘸取浓度为108个/mL的孢子悬浮液涂抹小菜蛾2齡幼虫体表[14]。其余操作同1.6.3。

1.7    数据统计和分析

将接虫后的养虫孔板移入室温（27±2） ℃，相对湿度60%～90%的观察室，观察虫体瘫软且连续3次触碰无反应时判定其死亡。逐日统计累计死亡率至用药后的1周。试验数据采用SPSS软件进行方差分析和差异显著性分析[15]。

2    结果与分析

2.1    不同浓度的饲料浸润法

从表1可以得出，接种7 d后，小菜蛾2龄幼虫的累计死亡率与不同的孢子悬浮液浓度之间呈正相关。3个菌株对小菜蛾2龄幼虫的致死效果存在明显差异。其中，菌株Bbyn-1对小菜蛾2龄幼虫的致死效果最好，其次是菌株Bbyn-2，但在孢子悬浮液浓度为1×105个/mL时，菌株Bbyn-3的致死效果更优，这可能与球孢白僵菌分生孢子在消化道的粘附力有关。

同一列的不同字母表示显著性差异（P<0.05）（下同）

Bbyn-1、Bbyn-2和Bbyn-3菌株在孢子悬浮液浓度为1×108个/mL时，接种7 d后，小菜蛾的累计死亡率分别为（97.66±0.62）%、（93.43±0.34）%和（94.42±0.77）%。袁盛勇[4]使用孢子浓度为2.3×108个/mL的球孢白僵菌，接种7 d后，小菜蛾的校正死亡率为77.4%。杨帆[8]使用孢子悬浮液浓度为108个/mL的球孢白僵菌，接种5 d后，小菜蛾的校正死亡率为（87.59±8.86）%。由此可见，本研究的3株球孢白僵菌对小菜蛾均有较好的致死效果。

2.2    不同接种量的饲料浸润法

室内毒力测定结果（表2）表明，3株球孢白僵菌菌株在接种7 d后对小菜蛾2龄幼虫的毒力随着接种量的增加而提高。比较3株球孢白僵菌不同接种量对小菜蛾2龄幼虫的累计死亡率，发现球孢白僵菌菌株Bbyn-1的毒力最强，其接种量为50 μL时，累计死亡率即可达到（94.48±0.3）%。

2.3    3株球孢白僵菌浸虫法与涂抹法的累计死亡率

在孢子悬浮液浓度不变的情况下，球孢白僵菌菌株对小菜蛾2龄幼虫的累计死亡率与接种时间呈正相关。随着接种时间的延长，累计死亡率逐渐增高。如Agboyi L K[6]所述，影响小菜蛾死亡率的因素之一是接种时间。

浸虫法中3株球孢白僵菌对小菜蛾的致死趋势相同，在第2天进入高发病期，第4天累计死亡率均达到50%以上，第6 天累计死亡率均达到80%以上。接种5 d后，菌株Bbyn-3对2龄小菜蛾的致死效果最高；涂抹法中3株球孢白僵菌的毒力由高到低依次为菌株Bbyn-2>菌株Bbyn-1>菌株Bbyn-3。在第4 天时，累计死亡率均未达到50%，第6 天时只有菌株Bbyn-2达到了80%以上。因此，菌株Bbyn-2在涂抹法中对2龄小菜蛾的致死率效果更好。

2.4    不同接种方式的死亡率

3株球孢白僵菌的不同接种方式对小菜蛾2龄幼虫均有较高的致死率。但饲料浸润法与浸虫法的防治效果要优于涂抹法，球孢白僵菌菌株Bbyn-1、Bbyn-2、Bbyn-3在饲料浸润法接种7 d后的累计死亡率分别达到98.02%、93.06%、94.87%；浸虫法接种7 d后的累计死亡率分别为95.34%、94.72%、96.94%；涂抹法接种7 d后的累计死亡率分别为88.69%、93.71%、76.67%。

2.5    小菜蛾感染球孢白僵菌后的外部症状

3种接种方式处理小菜蛾2龄幼虫后均有僵虫出现，说明3株球孢白僵菌对小菜蛾幼虫有确切的致死效果，且僵虫均出现在病虫死亡后的2～3 d。

感染初期，其病虫外表与健康虫体并无明显差异，且虫体颜色变为绿色（A）；随着感染时间延长，小菜蛾活动反应迟缓，无吐丝行为；死亡后虫体色变黑。此现象与闫喜中[3]所观察的结果一致。死亡48 h后，虫体出现白色菌丝，在节间褶部位白色菌丝明显（B）。随着感染时间的增加，虫体逐渐被白色菌丝覆盖，且虫体开始萎缩，并快速长出分生孢子，遍体如附白粉（C）。该过程与刘忱[16]观察球孢白僵菌浸染玉米螟的过程一致。

3    结论

本研究以小菜蛾为供试昆虫，对前期从湖北省恩施州所采集的草地贪夜蛾僵蚕体上分离获得的三株球孢白僵菌Bbyn-1、Bbyn-2和Bbyn-3进行室内毒力测定。结果表明：3株球孢白僵菌菌株对小菜蛾2龄幼虫均有侵染效果，但感染昆虫的能力各不相同。在不同孢子悬浮液和不同接种量的处理中，对小菜蛾2龄幼虫毒力最高的是菌株Bbyn-1，且毒力与孢子悬浮液浓度和接种量呈正相关。这个现象不仅表现在对小菜蛾防治中，在草地贪夜蛾防治中同样存在[17]；在涂抹法的处理中，菌株Bbyn-2对小菜蛾2龄幼虫的毒力显著高于菌株Bbyn-1和Bbyn-3；在浸虫法的处理中，前期菌株Bbyn-2的毒力较高，后期菌株Bbyn-3的毒力效果最好。球孢白僵菌主要通过昆虫体壁、气节、伤口等外部途径或消化道、呼吸道等内部途径进入。因此，影响球孢白僵菌杀虫毒力的因素有很多，包括不同菌株对寄主的粘附力与适应性、菌株来源寄主物种不同[18]、次生代谢产物的种类和毒力、温度、湿度、接种方式等，菌株Bbyn-3的较低性能可能与粘附性和浸染角质层的能力有关。

Lakpo K[6]发现球孢白僵菌菌株Bb11在每周施药两次时能够有效将农场中小菜蛾的密度降低93%。BATHINA P[19]采用离体叶片法对小菜蛾进行生物测定，在接种15 d后小菜蛾2龄幼虫死亡率最高为70%～80%。袁盛勇[4]利用球孢白僵菌MZ041016菌株分生孢子不同梯度对小菜蛾的致病性进行测定，在分生孢子浓度为2.3×108孢子/mL时，接种8 d后小菜蛾的校正死亡率为92.4%。雷研圆[14]将孢子悬浮液浓度为107个/mL的球孢白僵菌Bb02采用浸虫法接种7 d后，校正死亡率为73.79%，涂抹法接种7 d后校正死亡率为68.28%。与同类研究报道相比，本研究的3株球孢白僵菌菌株对2龄小菜蛾均有较强的毒力，其中菌株Bbyn-1和菌株Bbyn-2致病性更高，具有進一步研究和开发的潜力。

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Virulence of Three Strains of Beauveria bassianaaganist Plutella xylostella

WANG Yanni1，LI Min1，DUAN Xianli1，LONG Tong2，LI Wenjing3，ZHAO Jinfang1

（1 Key Laboratory of Fermentation Engin.Ministry of Education，Hubei Univ. of Tech.，Wuhan 430068，China； 2 Hubei Academy of Agricultural Sciences，Biopesticide Engin.Research Centre，Wuhan 430064，China；3 Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Central China，Ministry of Agriculture and Rural Affairs， P. R. China，Wuhan 430064，China）

Abstract：Three strains of  Beauveria bassiana， Bbyn-1， Bbyn-2， and Bbyn-3 isolated from silkworm of Spodoptera frugiperda  （Enshi， Hubei Province） were bioassayed against the second instar larvae of Plutella xylostella. The results showed that the cumulative mortality of Bbyn-1 was 97.66% in the 10  8 conidia/mL. When the inoculation volume is 150 μL， the cumulative mortality of Bbyn-1 can rise up to 99.67%. After inoculating for 7 days， the cumulative mortality of Bbyn-3 was the highest 96.94% by the immersion method， and the cumulative mortality of Bbyn-2 was 93.71% by the smear method. The results also showed that the three strains of Beauveria bassiana had certain effect to Plutella xylostella. The virulence was higher than Bbyn-2 and Bbyn-3 strain， especially Bbyn-1 strain， which has the potential for further research and development.

Keywords：Beauveria bassiana; virulence; Plutella xylostella

［責任编校： 张众］